Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH: R03 DK089061-01 (VKY), NIH: K08 DK068391 (VKY) Diabetes och Endokrinologi Research Center-(DERC - P30DK079638) vid Baylor College of Medicine, en pilot och genomförbarhetsstudie bidrag från den DERC (VKY), Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

HDAds har utvecklats för att övervinna den svaga tidiga generationen annonser och utnyttja för genterapi applikation. Men tekniska utmaningar återstår. Till exempel kräver HDAd HV för HDAd förpackning och vektor förstärkning är inte lika effektiv som tidiga generationen annonser. HV är ett första generationens annons och kontaminering av HV kompromiss effektivitet HDAd. Därför mycket effektiv transfektion och optimala förhållanden för varje seriepassage är kritiska. En annan kritisk parameter för vektorproduktion är vilken passage (P1-P4) bör användas för efterföljande passage 5 som direkt används som inokulum för suspensionsceller. Till vår erfarenhet är de bästa resultaten erhålls genom att använda passagen genom vilken HDAd vektor andel dramatiskt i följande avsnitt (P3 i figur 2). Utbytet för HDAd vektorer beror på transgena kassetter. Under vektor produktion båda transgenerna uttrycks eftersom båda generna är underallestädes närvarande promotor. Ngn3 är en transkriptionsfaktor och BTC är en tillväxtfaktor, vilket tyder på att HDAd vektor som uttrycker transkriptionsfaktor som kan påverka cellinje hämmar vektor förstärkning medan uttrycker tillväxthormon hjälper vektorreplikation och förpackning. Med diabetes antar epidemiska proportioner, nya metoder för att återställa B-cell massa som krävs. I denna rapport beskriver vi metoder för att utnyttja fördelarna med HDAd vektorer för att åstadkomma genöverföring av ö-härstamning, definition transkriptionsfaktor, Ngn3 tillsammans med den lilla ön tillväxtfaktor, till betacellulin framkalla holme neogenesis i periportala regioner i levern. För att bedöma effekten av detta är det viktigt att välja möss med stabil hyperglykemi och se till att lämpliga kontroller alltid ingår. För detta experiment genöverföring, behandlade den tomma vektorn diabetiska möss alltid bör användas. Dessutom, med hjälp av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC individuellt behandlad diabetes kmce tjänar att testa enskilda bidraget från dessa två gener i holme neogenesis. Eftersom våra data visar att Ngn3 ensam är tillräcklig för att inducera holme neogenesis, men tillsatsen av tillväxtfaktorn, BTC, tjänar till att förstärka svaret leder till robusta induktion av ö neogenesis. Det är också viktigt att testa att vektorn expressionen verkligen uppnås i målvävnaden, levern och även att visa att insulinet analyseras i plasman hos behandlade möss inte kommer från kvarvarande cellöar i bukspottkörteln, genom att visa frånvaron av pankreatiska cellöar i diabetiska möss. Sammanfattningsvis ligger fördelen med HDAd-vektorsystem för genöverföring i dess höga kapacitet kloning, effektiv transduktion och långvarig genexpression i levern med minsta kronisk toxicitet samt dess karaktär av icke-integrering av vektorgenomet i värden kromosom. De primära begränsningarna är de komplexa stegen i sin generation och dessin vivo-applikation är primärt begränsad till levern med den mest populära annonser serotyp 5. Holme neogenesis kan induceras till fullo återställa plasma insulin och glukos tolerans i diabetiska möss genom att inducera ö neogenesis i levern genom genöverföring av ö härstamning-definierad transkriptionsfaktor, Ngn3 tillsammans med den lilla ön tillväxtfaktorn, betacellulin. I denna rapport visar vi den optimala protokollet för att generera hög kvalitet HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC, och visa tekniker att inducera och bedöma holme neogenesis i levern hos diabetiska möss att vända hyperglykemi. Fotnot: De virala vektorer och cellinjer som beskrivs här är tillgängliga från Vector Production Core-Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Vissa kommersiella kit finns också för att generera HDAd virus (t.ex. Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> ProFectionR däggdjur transfektion kit </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69.504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdeoxikolat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillin streptomycin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNas </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNas I, klass II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glasspinnaren kolvar </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glasspinnaren kolvar </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Skjut A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Rör OptiSeal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362.181 </td></tr><tr><td> Cesiumklorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrifug </td></tr><tr><td> Filter </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugrör 500 meterl </td><td> Corning </td><td> 431.123 </td></tr><tr><td> tailveiner fixeringsutrustning </td><td> Braintree vetenskapliga, INC </td><td> TV-150 </td></tr><tr><td> Insulin, mus ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glukos </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mus-C-peptid ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> marsvin-anti-insulin-antikropp </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> get-anti-Pdx1 antikropp </td><td> gåva från Dr Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> mus anti-antikropp Ngn3 </td><td> Beta cellbiologi Consortium, Univ. of Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> mus anti-antikropp Nkx6.1 </td><td> Beta cellbiologi Consortium, Univ. av Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anti-betacellulin antikropp </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Färgreagens SET. </td><td> Teco Diagnostik </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), färg Endpoint Reagens Set </td><td> Teco Diagnostik </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Särskilda reagenser och utrustning.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Typ 1-diabetes orsakas av T-cell-medierad autoimmun destruktion av insulin-producerande celler i bukspottkörteln. Hittills insulin ersättare är fortfarande den största terapi, eftersom ö transplantation har begränsats av givare tillgänglighet och av behovet av långsiktig immunsuppression. Inducerad holme neogenesis genom genöverföring av Neuogenin3 (Ngn3), den lilla ön härstamning, definiera specifika transkriptionsfaktor och betacellulin (BTC), har en liten ö tillväxtfaktor potential att bota typ 1-diabetes. Adenovirusvektorer (Ads) är mycket effektiva genöverföringsvektor, men tidiga generationen annonser har flera nackdelar för användning in vivo. Hjälpare beroende annonser (HDAds) är de mest avancerade annonser som utvecklats för att förbättra säkerhetsprofilen för tidig generation annonser och förlänga transgenexpression 1. De saknar kronisk toxicitet eftersom de saknar virala sekvenser 2-5 och behålla endast Ad cis-elements nödvändiga för vektorreplikation och förpackning. Detta möjliggör kloning av upp till 36 kb gener. I detta protokoll beskriver vi den metod för att generera HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC och leverera dessa vektorer i STZ-inducerade diabetiska möss. Våra resultat visar att samtidig injektion av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC inducerar &#39;neo öar &quot;i levern och vänder hyperglykemi hos diabetiska möss.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Vi beskriver hepatisk neo-ö formation i STZ (streptozotocin)-inducerad diabetiska möss genom genöverföring av Neurogenin3 (Ngn3) och betacellulin (BTC) med hjälpare-beroende adenovirusvektor (HDAd) och återföring av hyperglykemi. Vår metod tar fördelar hjälpare beroende adenovirusvektorer med sin mycket effektiva in vivo transduktion och långvariga genuttryck.

Neo-Islet Bildning i Lever från diabetiska möss genom Helper-beroende adenovirusvektor genöverföring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Användning av en hängande vikt System för Lever Ischemi i möss

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Fastställande och spridning av mänskliga Retinoblastom Tumörer i Immune deficienta möss

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Genöverföring för ischemisk hjärtsvikt I en preklinisk modell

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Bedömning av magtömning i icke-feta diabetiska möss Använda en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-oktansyra utandningstest

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Kärl Gene Transfer från Metallic Stent Ytor Använda adenovirusvektorer Tethered genom hydrolyser tvärbindare

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile Duct Tion hos möss: Induktion av inflammatoriska leverskada och fibros av obstruktiv Kolestas

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Funktionell Human Liver Bevarande och inkassering av belopp genom Subnormothermic Machine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Genöverföring till kanin gemensamma halspulsådern endotelet

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protokoll för att skapa kroniska sår hos diabetiska möss

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-medierad genterapi av hepatocyter Ex Vivo för autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...