Name: flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Vi vil gerne takke M. Höxter for teknisk bistand i forbindelse med sortering primær murine AECII fra biosikkerhedsniveau 2 prøver. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den tyske Research Foundation (DFG) til DB (SFB587, TP B12 og BR2221/1-1) og et stipendium fra Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) til AA. DB understøttes af formandens initiativ og netværk Fund af Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) under kontrakt nummer W2/W3-029.

Detaljer vedrørende nødvendige reagenser og materialer er anført i tabellen i slutningen af ​​protokollen nedenfor. Inden arbejdet påbegyndes, forberede 15 ml rør (en pr mus) indeholdende 4 ml dispase og præ-varm dem til 37 ° C i et vandbad. I en varmeblok, varme kort tid små portioner af 1% lavtsmeltende agarose (i vand) til 95 ° C, indtil flydende og derefter afkøles til 45 ° C indtil anvendelse. 1. Fremstilling af muselunge <ol><li> Sacrifice musen ved CO 2 kv?...

<ol>
	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

Vores protokol til isolering af murine AECII ved flowcytometri tilbyder en hurtig måde at få adgang primære celler fra muselunge for en lang række funktionelle og molekylære studier. Den beskrevne fremgangsmåde giver stærkt levedygtige og rene populationer af AECII som er tilstrækkelige i antal til direkte efterfølgende analyser, såsom RNA-isolering (se figur 2b) og transkriptom undersøgelser. For funktionelle anvendelser er det også muligt at dyrke de isolerede celler, hvilket tillader ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> indlagt kanyle Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5000 caseinolytiske enheder) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.235 </td><td> portion til 4 ml i 15 ml rør, opbevares ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym Plaque Agarose </td><td> Biozym </td><td> 840.101 </td><td> 1% vægt / volumen i H2O </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease I fra bovin pancreas, 2000 Kunitz enheder / hætteglas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> frisk opløse indholdet af 1 hætteglas i 300 gl DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> anvendes som fastsat af fabrikanten (Low Glucose, pyruvat, HEPES) </td></tr><tr><td> celle sier (100 um, 75 um) </td><td> BD Falcon </td><td> 352.360, 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> nylon mesh (48 um, 30 um) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 um filter </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-mus CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101.302 </td><td> klon 93; oprenset </td></tr><tr><td> anti-muse F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123.116 </td><td> klon BM8; APC koblet </td></tr><tr><td> anti-muse-CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101.208 </td><td> klon M1/70; PE koblet </td></tr><tr><td> anti-muse-CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117.310 </td><td> klon N418; APC koblet </td></tr><tr><td> anti-muse-CD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103.102 </td><td> klon 30-F11; oprenset </td></tr><tr><td> anti-muse-CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> Ebio 1D3; PE koblet </td></tr><tr><td> polyklonalt gede-anti-rotte IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550.767 </td><td> polyklonale, PE coupled </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antistoffer koblet til alternative fluorochromer kan anvendes, afhængigt af flowcytometeret og lasere til rådighed. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

Gennem de seneste år har bidraget fra alveolære type II epithelceller (AECII) til forskellige aspekter af immun regulering i lungen i stigende grad blevet anerkendt. AECII har vist sig at deltage i cytokinproduktion i betændte luftveje og også fungere som antigenpræsenterende celler i både infektion og T-cellemedieret autoimmunitet 1-8. Derfor er de særligt interessant også i kliniske sammenhænge, ​​såsom luftvejene hyper-reaktivitet til udenrigs-og selv-antigener samt infektioner, der direkte eller indirekte rettet mod AECII. Men vores forståelse af de detaljerede immunologiske funktioner betjenes af alveolære type II epitelceller i den raske lunge samt i inflammation forbliver fragmentarisk. Mange undersøgelser vedrørende AECII funktion udføres ved anvendelse af muse-eller humane alveolære epitelcellelinier 9-12. Arbejde med cellelinjer sikkert tilbyder en række fordele, såsom tilgængeligheden af ​​et stort antal of celler for omfattende analyser. Vi mener imidlertid, at anvendelsen af ​​primære murine AECII giver en bedre forståelse af den rolle, denne celletype i komplekse processer som infektion eller autoimmun inflammation. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr, der lider af sådanne luftvejssygdomme, hvilket betyder at de har været udsat for alle yderligere ydre faktorer spiller en rolle i den analyserede indstilling. Som et eksempel kan levedygtige AECII isoleres fra mus intranasalt inficeret med influenza A-virus, der primært retter sig mod disse celler til replikation 13. Vigtigere, gennem ex vivo infektion af AECII isoleret fra raske mus, kan undersøgelser af de cellulære reaktioner monteret ved infektion forlænges yderligere. Vores protokol til isolering af primære murine AECII er baseret på enzymatisk fordøjelse af muselunge efterfulgt af mærkning af den resulterende cellesuspension med antistoffer specifikke for CD11c, CD11, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII derefter identificeret som det umærkede og sideværts spredning høj (SSC høj) cellepopulation og adskilles ved fluorescensaktiveret cellesortering 3. I forhold til alternative fremgangsmåder til isolering af primære epitelceller fra muselunger, giver vores protokol til flowcytometrisk isolering af AECII ved negativ selektion uberørt, meget levedygtig og ren AECII på forholdsvis kort tid. Derudover og i modsætning til konventionelle fremgangsmåder til isolering ved at panorere og udtømning af lymfocytter via binding af antistof-koblede magnetiske perler 14, 15, tillader flowcytometrisk celle-sortering diskrimination ved cellestørrelse og granularitet. Eftersom instrumentering til flowcytometrisk cellesortering er tilgængelig, kan den beskrevne procedure anvendes ved relativt lave omkostninger. Ved siden af ​​standard-antistoffer og enzymer til lunge disintegration, ingen yderligere reagenser såsom magnetiskperler er nødvendige. De isolerede celler er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser, som omfatter in vitro-dyrkning og T-celle stimulation assays samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.

Når sortering lunge cellesuspensioner isoleret fra raske mus, vil AECII gate typisk tegner sig for omkring 42 ± 10% af alle begivenheder. Denne procentdel kan være mærkbart lavere, når mus med åndedrætssygdomme såsom en virusinfektion anvendes, som den oprindelige cellesuspension vil indeholde en væsentlig højere andel af lymfocytter og andre immunceller rekrutteret til luftvejene. For AECII isoleret fra iav inficerede lunger på dag 3 efter infektion har vi observeret en nedsættelse af hyppigheden af ​​c...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Vi beskriver den hurtige isolering af primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) ved flowcytometrisk negativ selektion. Disse AECII viser høj levedygtighed og renhed og er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser af deres rolle i respiratoriske tilstande, såsom autoimmune eller infektiøse sygdomme.

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse af epitelbeskadigelse Produceret af<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering og Flowcytometrisk karakterisering af murine Lille Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering af neutrofile-afledte mikropartikler for funktionelle studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolering af dendritiske celler fra det menneskelige kvindelige forplantningsorganerne for Phenotypical og funktionelle studier

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...