Name: flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Nous tenons à remercier M. Höxter d&#39;assistance technique dans le tri primaire AECII murin de niveau de biosécurité 2 échantillons. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande de recherche (DFG) à DB (SFB587, TP B12 et BR2221/1-1) et une bourse de l&#39;École Hanovre recherche biomédicale (DFG CGC 108) à AA. DB est soutenu par l&#39;Initiative du Président et du Fonds de réseautage de l&#39;Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF), sous le numéro de contrat W2/W3-029.

Les détails concernant les réactifs et les matériaux requis sont répertoriés dans le tableau à la fin du protocole ci-dessous. Avant de commencer à travailler, préparer des tubes de 15 ml (un par souris) contenant 4 ml de dispase et préchauffer les à 37 ° C dans un bain-marie. Dans un bloc de chauffage, chauffer rapidement de petites aliquotes de 1% d&#39;agarose bas point de fusion (dans l&#39;eau) à 95 ° C jusqu&#39;à ce que liquéfié et ensuite refroidir à 45 ° C jusqu&#39;à utilisation. <p clas...

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	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

Notre protocole pour l&#39;isolement des murin AECII par cytométrie en flux offre un moyen rapide d&#39;accéder à des cellules primaires du poumon de souris pour toute une série d&#39;études fonctionnelles et moléculaires. La procédure décrite donne populations très viables et pure de AECII qui sont en nombre suffisant pour les analyses ultérieures directes, telles que l&#39;ARN isolés (voir figure 2b) et l&#39;étude du transcriptome. Pour les applications fonctionnelles, il est également p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> demeure canule 22G Introcan </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5000 unités caséinolytiques) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> aliquote de 4 ml en tubes de 15 ml, à -20 ° C </td></tr><tr><td> Plaque Biozym Agarose </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% p / v dans H 2 O </td></tr><tr><td> Désoxyribonucléase I de pancréas bovin, 2000 unités Kunitz / flacon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> fraîchement dissoudre le contenu de 1 flacon dans 300 ul de DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> utilisé tel que prévu par le fabricant (Low Glucose, pyruvate, HEPES) </td></tr><tr><td> crépines cellulaires (100 um, 75 um) </td><td> BD Falcon </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> filet de nylon (48 um, 30 um) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics filtre 50 um </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-souris CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> clone 93; purifié </td></tr><tr><td> anti-souris F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> clone BM8; APC couplage </td></tr><tr><td> anti-souris CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> clone M1/70; PE couplée </td></tr><tr><td> anti-souris CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> clone N418, couplé APC </td></tr><tr><td> anti-sourisCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> clone 30-F11; purifié </td></tr><tr><td> anti-CD19 de souris </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE couplage </td></tr><tr><td> polyclonal de chèvre anti-IgG de rat </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyclonal, PE couplage </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anticorps couplés à des fluorochromes alternatives peuvent être utilisées, selon le cytomètre de flux et de lasers disponibles. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

Au cours des dernières années, la contribution des cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) à divers aspects de la régulation du système immunitaire dans le poumon a été de plus en plus reconnue. AECII Il a été démontré à participer à la production de cytokines dans les voies respiratoires enflammées et même agir comme cellules présentatrices d&#39;antigène à la fois l&#39;infection et des lymphocytes T auto-immunité médiée par 1-8. Par conséquent, ils sont particulièrement intéressants dans les contextes cliniques tels que l&#39;hyper-réactivité des voies aériennes à l&#39;étranger et des auto-antigènes ainsi que les infections qui ciblent directement ou indirectement AECII. Cependant, notre compréhension des fonctions immunologiques détaillées desservis par les cellules alvéolaires de type II épithéliales des poumons en bonne santé ainsi que dans l&#39;inflammation reste fragmentaire. De nombreuses études concernant la fonction AECII sont effectuées à l&#39;aide de la souris ou l&#39;homme lignées de cellules épithéliales alvéolaires 9-12. Travailler avec des lignées de cellules offre certes de nombreux avantages, tels que la disponibilité d&#39;un grand nombre of cellules pour des analyses approfondies. Cependant, nous croyons que l&#39;utilisation de AECII murin primaire permet une meilleure compréhension du rôle de ce type de cellules dans des processus complexes comme l&#39;infection ou une inflammation auto-immune. Primaire AECII murin peut être isolé directement à partir d&#39;animaux qui souffrent de ces affections respiratoires, ce qui signifie qu&#39;ils ont été soumis à tous les autres facteurs extrinsèques jouent un rôle dans la mise en analysés. A titre d&#39;exemple, AECII viable peut être isolé à partir des souris infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe A, qui touche principalement les cellules à la réplication 13. En outre, grâce infection ex vivo de AECII isolés de souris saines, l&#39;étude des réponses cellulaires montés lors de l&#39;infection peut être prolongée. Notre protocole pour l&#39;isolement de AECII murin primaire est basée sur la digestion enzymatique de la souris suivies par les poumons d&#39;étiquetage de la suspension cellulaire obtenue avec des anticorps spécifiques de CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 et CD16/CD32. AECII granulaires sont ensuite identifiés comme non marqué et la dispersion latérale élevée (SSC haut) et population de cellules sont séparées par tri cellulaire activé par fluorescence 3. En comparaison à d&#39;autres méthodes d&#39;isolement de cellules primaires épithéliales de poumons de souris, notre protocole d&#39;isolement par cytométrie de flux AECII par sélection négative donne intacte, très viable et pur AECII dans un temps relativement court. En outre, et contrairement aux méthodes conventionnelles d&#39;isolement par le panoramique et l&#39;épuisement des lymphocytes par l&#39;intermédiaire de la liaison de l&#39;anticorps couplés billes magnétiques 14, 15, cytométrie en flux de tri cellulaire permet la discrimination par le biais de la taille des cellules et la granularité. Étant donné que l&#39;instrumentation pour le tri cellulaire par cytométrie en flux est disponible, la procédure décrite peut être appliquée à des coûts relativement faibles. Suivant les anticorps et les enzymes standards pour la désintégration du poumon, pas de réactifs supplémentaires tels que magnétiqueperles sont nécessaires. Les cellules isolées sont adaptés à un large éventail d&#39;études fonctionnelles et moléculaires, notamment la culture in vitro et des essais de stimulation des cellules T ainsi que transcriptome, du protéome ou des analyses sécrétome 3, 4.

Lors du tri des suspensions de cellules pulmonaires isolées à partir de souris saines, la porte sera AECII représentent généralement environ 42 ± 10% de tous les événements. Ce pourcentage peut être nettement plus faible lorsque les souris atteintes de maladies respiratoires telles que une infection virale sont utilisées, comme la suspension cellulaire initiale contient une proportion considérablement plus élevée de lymphocytes et d&#39;autres cellules immunitaires recrutées pour les voies respiratoires. P...

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Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Nous décrivons l&#39;isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d&#39;études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

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