Name: flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Vi vil gjerne takke M. Höxter for teknisk assistanse i sortering primære murine AECII fra biosikkerhetsnivå 2 prøver. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) til DB (SFB587, TP B12 og BR2221/1-1) og et stipend fra Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) til AA. DB er støttet av presidentens initiativ og nettverk fond i Helmholtz Association of German Forskning Centers (HGF) under kontrakt nummer W2/W3-029.

Detaljer vedrørende nødvendige reagenser og materialer, er oppført i tabellen på slutten av protokollen nedenfor. Før arbeidet forberede 15 ml rør (en per mus) inneholdende 4 ml dispase og forvarme dem til 37 ° C i et vannbad. I en varmeblokk, kort tid varme små aliquoter av 1% lavt-smelte agarose (i vann) til 95 ° C inntil flytende og senere avkjøles til 45 ° C inntil bruk. 1. Klargjøring av Mouse Lung <ol><li> Ofre musen ved CO 2 kvelning. Merk: Ikke utfør cervica...

<ol>
	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

Vår protokoll for isolering av muse AECII ved strømningscytometri tilbyr en rask måte å få tilgang primærceller fra musen lungene for en hel rekke av funksjonelle og molekylære studier. Den beskrevne prosedyren gir svært levedyktige og rene populasjoner av AECII som er tilstrekkelig i antall for direkte påfølgende analyser, for eksempel RNA isolert (se figur 2b) og transkriptom studier. For funksjonelle anvendelser er det også mulig å dyrke de isolerte celler, slik f.eks generasjon ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> inneliggende kanyle Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5,000 caseinolytic enheter) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> alikvot til 4 ml i 15 ml rør, lagre ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym Plaque Agarose </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% w / v i H 2 O </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease jeg fra storfe bukspyttkjertelen, 2000 Kunitz enheter / hetteglass </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> ferskt oppløse innholdet av en ampulle i 300 ul DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> brukt som forutsatt av produsenten (Low Glucose, Pyruvat, HEPES) </td></tr><tr><td> celle siler (100 mikrometer, 75 mikrometer) </td><td> BD Falcon </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> nylon mesh (48 mikrometer, 30 mikrometer) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 mikrometer filter </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-mus CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> klone 93; renset </td></tr><tr><td> anti-mus F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> klone BM8; APC kombinert </td></tr><tr><td> anti-mus CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> klone M1/70; PE kombinert </td></tr><tr><td> anti-mus CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> klone N418; APC kombinert </td></tr><tr><td> anti-musCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> klon 30-F11; renset </td></tr><tr><td> anti-mus CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE kombinert </td></tr><tr><td> polyklonalt geite-anti-rotte IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyklonalt, PE kombinert </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antistoffer koblet til alternative fluorokromer kan brukes, avhengig strømningscytometeret og lasere tilgjengelige. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

Gjennom de siste årene har bidraget fra alveolære type II epitelceller (AECII) til ulike aspekter av immunsystemet regulering i lungene blitt stadig mer anerkjent. AECII har vist å delta i cytokin produksjon i betent luftveier og å selv fungere som antigen-presenterende celler i både infeksjon og T-celle mediert autoimmunitet 1-8. Derfor er de spesielt interessant også i kliniske sammenhenger som luftveiene hyper-reaktivitet til utenriks-og self-antigener og infeksjoner som direkte eller indirekte er rettet mot AECII. Forblir imidlertid vår forståelse av de detaljerte immunologiske funksjoner servert av alveolare type II epitelceller i sunn lunge samt i betennelse fragmentarisk. Mange studier om AECII funksjon utføres ved hjelp av musen eller menneskelige alveolære epitelceller cellelinjer 9-12. Arbeide med cellelinjer tilbyr sikkert en rekke fordeler, slik som tilgjengelighet av store tall of celler for omfattende analyser. Vi tror imidlertid at bruk av primær murine AECII gir en bedre forståelse av hvilken rolle denne celletypen i komplekse prosesser som infeksjon eller autoimmune betennelse. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr som lider av slike åndedrettsproblemer, som betyr at de har vært utsatt for alle andre ytre faktorer spiller en rolle i den analyserte innstillingen. Som et eksempel, kan levedyktig AECII isoleres fra mus intranasalt infisert med influensa A virus, som primært er rettet mot disse cellene for replikering 13. Viktigere, gjennom ex vivo infeksjon av AECII isolert fra friske mus, kan studier av cellulære responser montert på infeksjon bli ytterligere utvidet. Vår protokoll for isolering av primær murine AECII bygger på enzymatisk fordøyelse av musen lunge etterfulgt av merking av den resulterende cellesuspensjonen med antistoffer som er spesifikke for CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII blir deretter identifisert som den umerkede og sideveis scatter høy (SSC høy) cellepopulasjon og atskilles med fluorescens aktivert celle sortering 3. I forhold til alternative metoder for å isolere primære epitelceller fra mus lungene, gir vår protokoll for flowcytometrisk isolering av AECII etter negativ seleksjon urørt, høyst livskraftig og ren AECII i relativt kort tid. I tillegg, og i motsetning til konvensjonelle metoder for isolering ved å panorere og uttømming av lymfocytter via binding av antistoff-koplede magnetiske kuler 14, 15, tillater flowcytometrisk celle-sortering diskriminering ved hjelp av cellestørrelse og granularitet. Gitt at instrumentering for flowcytometrisk celle sortering er tilgjengelig, kan den beskrevne fremgangsmåte følges ved relativt lave kostnader. Ved siden av standard antistoffer og enzymer for lunge oppløsning, ingen ekstra reagenser som magnetiskperler kreves. De isolerte celler er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier, som inkluderer in vitro kultur og T-celle stimulering analyser samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.

Ved sortering lunge cellesuspensjoner isolert fra friske mus, vil AECII gate typisk utgjøre ca 42 ± 10% av alle hendelser. Denne prosentandelen kan være merkbart lavere når mus med respiratoriske tilstander som en virusinfeksjon er anvendt, den innledende cellesuspensjon vil inneholde en betydelig høyere andel av lymfocytter og andre immune celler som rekrutteres til luftveiene. For AECII isolert fra IAV infiserte lunger på dag 3 etter infeksjon har vi observert en reduksjon av frekvensen av celler i AECII gate me...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Vi beskriver den raske isolasjon av primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) etter flowcytometrisk negativ seleksjon. Disse AECII viser høy levedyktighet og renhet, og er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier innen sin respiratoriske tilstander som autoimmune eller smittsomme sykdommer.

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse av epitelisk skade produsert av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infeksjon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolasjon og Flowcytometriske Karakterisering av Murine Small Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolasjon og Flowcytometriske analyse av endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolering av dendrittiske celler fra den menneskelige kvinnelige skjede for Phenotypical og funksjonelle studier

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...