Name: flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Vi vill tacka M. Höxter för tekniskt stöd i sortering primär mus AECII från skyddsnivå 2 prover. Detta arbete har finansierats med bidrag från den tyska Research Foundation (DFG) till DB (SFB587, TP B12 och BR2221/1-1) och ett stipendium från Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) till AA. DB stöds av presidentens initiativ och nätverk fonden Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) enligt avtal nummer W2/W3-029.

Detaljer om erforderliga reagens och material visas i tabellen i slutet av protokollet nedan. Innan arbetet påbörjas, förbereda 15 ml rör (ett per mus) innehållande 4 ml dispas och pre-varmt dem till 37 ° C i ett vattenbad. I ett värmeblock, värma kort små alikvoter av 1% låg-smälta agaros (i vatten) till 95 ° C tills flytande och därefter svalna till 45 ° C fram till användning. 1. Beredning av muslunga <ol><li> Offra musen genom CO 2 kvävning. Obs: Utför inte ...

<ol>
	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

Vår protokoll för isolering av murina AECII genom flödescytometri erbjuder ett snabbt sätt att komma åt primära celler från mus lunga för en hel rad av funktionella och molekylära studier. Den beskrivna proceduren ger mycket livskraftiga och rena populationer av AECII som är tillräckliga i antal för direkt efterföljande analyser, såsom RNA isolering (se figur 2b) och transkriptom studier. För funktionella applikationer, är det också möjligt att odla de isolerade cellerna, vilket t....

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> kvarliggande kanyl Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispas, 100 ml (5000 kaseinolytiska enheter) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.235 </td><td> alikvot till 4 ml i 15 ml rör, förvara vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> Biozym Plack Agaros </td><td> Biozym </td><td> 840.101 </td><td> 1% vikt / volym i H 2 O </td></tr><tr><td> Deoxiribonukleas I från bovin pankreas, 2000 Kunitz enheter / flaska </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> nyligen Lös innehållet i 1 injektionsflaska i 300 ul DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> används som tillhandahålls av tillverkaren (Lågt Glucose, pyruvat, HEPES) </td></tr><tr><td> cell silar (100 nm, 75 nm) </td><td> BD Falcon </td><td> 352.360, 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> nylonnät (48 | im, 30 pm) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 pm filter </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-mus CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101.302 </td><td> klon 93; renat </td></tr><tr><td> anti-mus F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123.116 </td><td> klon BM8; APC kopplad </td></tr><tr><td> anti-mus CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101.208 </td><td> klon M1/70, PE kopplad </td></tr><tr><td> anti-mus CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117.310 </td><td> klon N418; APC kopplad </td></tr><tr><td> anti-musCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103.102 </td><td> klon 30-F11; renad </td></tr><tr><td> anti-mus CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1d3, PE kopplad </td></tr><tr><td> polyklonal get-anti-rått-IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550.767 </td><td> polyklonal, PE kopplad </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikroppar kopplade till alternativa fluorokromer kan användas, beroende på flödescytometern och lasrar tillgängliga. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

Under de senaste åren har bidrag alveolära typ II epitelceller (AECII) till olika aspekter av immunreglering i lungan alltmer klart. AECII har visats delta i cytokinproduktion i inflammerade luftvägarna och att även fungera som antigenpresenterande celler i både infektion och T-cellsmedierad autoimmunitet 1-8. Därför är de särskilt intressanta även i kliniska sammanhang, såsom luftvägarna hyperreaktivitet utrikes-och själv-antigener samt infektioner som direkt eller indirekt riktar AECII. Förblir dock vår förståelse av de detaljerade immunologiska funktioner betjänas av alveolära typ II epitelceller i friska lungan samt vid inflammation fragmentariskt. Många studier om AECII funktion utförs med mus eller människa alveolära epitelceller cellinjer 9-12. Arbeta med cellinjer verkligen erbjuder en rad fördelar, till exempel tillgången till ett stort antal of celler för omfattande analyser. Vi tror dock att använda primära murina AECII möjliggör en bättre förståelse för den roll som denna celltyp i komplexa processer som infektion eller autoimmun inflammation. Primär murina AECII kan isoleras direkt från djur som lider av sådana luftvägsbesvär, vilket innebär att de har varit föremål för alla ytterligare yttre faktorer spelar en roll i det analyserade inställningen. Som ett exempel, kan livskraftigt AECII isoleras från möss intranasalt infekterade med influensa A-virus, som riktar sig främst till dessa celler för replikering 13. Viktigare, genom ex vivo-infektion av AECII isolerats från friska möss, kan studier av cellulära svar monterade på infektion förlängas ytterligare. Vår protokoll för isolering av primära murina AECII baseras på enzymatisk digerering av muslunga, följt av märkning av den resulterande cellsuspensionen med antikroppar specifika för CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 och CD16/CD32. Granulära AECII identifieras därefter som den omärkta och sidled spridning hög (SSC hög) cellpopulationen och är åtskilda av fluorescensaktiverad cellsortering 3. I jämförelse med alternativa metoder för att isolera primära epitelceller från mus lungorna, ger vår protokoll för flödescytometrisk isolering av AECII genom negativ selektion orörd, mycket livskraftig och ren AECII på relativt kort tid. Dessutom, och i motsats till konventionella metoder för isolering genom panorering och utarmning av lymfocyter genom bindning av antikropp-kopplade magnetiska pärlor 14, 15, medger flödescytometrisk cell-sortering diskriminering genom cellstorlek och granularitet. Med tanke på att instrumentering för flödescytometrisk cellsortering är tillgänglig, kan det beskrivna förfarandet tillämpas på relativt låga kostnader. Bredvid standard antikroppar och enzymer för lung sönderfall, inga ytterligare reagens såsom magnetiskpärlor erfordras. De isolerade cellerna är lämpliga för ett brett spektrum av funktionella och molekylära studier, som omfattar odling in vitro och T-cell-analyser stimulering samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.

Vid sortering suspensioner lung cell som isolerats från friska möss kommer AECII porten står vanligtvis för cirka 42 ± 10% av alla händelser. Denna procentsats kan vara märkbart lägre när möss med respiratoriska sjukdomar såsom en virusinfektion används, eftersom den initiala cellsuspensionen innehåller en betydligt större andel av lymfocyter och andra immunceller som rekryteras till luftvägarna. För AECII isolerad från iav infekterade lungor på dag 3 efter infektion har vi observerat en minskning av f...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Vi beskriver snabb isolering av primära murina typ II alveolära epitelceller (AECII) genom flödescytometrisk negativ selektion. Dessa AECII visar hög lönsamhet och renhet och är lämpliga för ett brett spektrum av funktionella och molekylära studier om deras roll i respiratoriska sjukdomar såsom autoimmuna eller infektiösa sjukdomar.

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analys av epitelskada Producerad av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera perifera mononukleära blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering och Flödescytometriska karakterisering av murina tunntarms lymfocyter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av Human Endocervikala Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering och karakterisering av neutrofiler-derived mikropartiklar för funktionella studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolering av dendritiska celler från mänskliga kvinnliga fortplantningsorganen för fenotypiska och funktionella studier

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...