Name: generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00
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Estes estudos foram financiados em parte pelo NIH Prêmio UO1HL107443-01 a GJM e GM.

1. Isolamento e expansão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) DIA 0 <ol><li> Aspire 4 ml de sangue periférico num Vacutainer CPT BD Tubo Preparação celular com citrato de sódio. Inverter o tubo de 8 a 10 vezes e centrifugar a 1800 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Idealmente, esta etapa deve ser feito dentro de 2 horas da coleta. </li><li> Recolher as células mononucleares (MCs), pipetando buffy coat (camada de células entre barreira de gel e de plasma) para ...

<ol>
	<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li><li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li><li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34(-)+cells,+outweighing+the+contribution+of+CD34(+)+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples.">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li></ol>

Descrevemos aqui a utilização do vector lentiviral STEMCCA para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares isoladas de alguns mililitros de solução recentemente colhido sangue periférico. O protocolo pode também ser usado para reprogramar PBMCs congelados (obtido directamente a partir de buffy coat), um detalhe de implicações práticas quando se utilizam células de dador adquiridas a partir de um local distante. Antes da indução de reprogramação, PBMCs isoladas deve ser submetida a um passo de e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com citrato de sódio </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Médio Stem Cell </td><td> Qualidade Biológica </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Substituição Knockout Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Não-essenciais Aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Biomedicals MP </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-PE </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES celular Kit Amostra Marcador </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector

Através da expressão ectópica de quatro factores de transcrição, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, as células somáticas humanas pode ser convertido para um estado pluripotente, gerando assim chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 1-4. Específicas do paciente iPSCs faltam as preocupações éticas que envolvem as células-tronco embrionárias (CTEs) e seria ignorar rejeição imunológica possível. Assim, iPSCs têm atraído considerável atenção para estudos de doenças de modelagem, a triagem de compostos farmacológicos e terapias regenerativas 5. Nós mostramos a geração de transgene livres iPSCs humanos a partir de pacientes com doenças pulmonares diferentes, utilizando um único coletável policistrónica lentiviral Cassete Stem Cell (STEMCCA) codificando os factores Yamanaka 6. Estas linhas iPSC foram gerados a partir de fibroblastos da pele, o tipo celular mais comum utilizado para a reprogramação. Normalmente, a obtenção de fibroblastos requer uma biópsia por punção da pele seguido de expansão das célulass na cultura de algumas passagens. É importante notar que um certo número de grupos têm relatado a reprogramação de células humanas de sangue periférico em iPSCs 7-9. Num estudo, uma versão induzível Tet do vector STEMCCA foi empregue 9, o que exigia que as células do sangue a ser simultaneamente infectadas com um lentivírus constitutivamente activo que codifica a tetraciclina reversa transactivador. Em contraste com os fibroblastos, células do sangue periférico podem ser recolhidas através de procedimentos minimamente invasivos, reduzindo o desconforto e sofrimento do paciente. Um protocolo simples e eficaz para a reprogramação de células de sangue utilizando um único vetor constitutivo coletável pode acelerar a aplicação da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Além disso, a reprogramação de células de sangue periférico permite a geração de iPSCs de indivíduos em que as biópsias da pele devem ser evitados (ie. Aberrante cicatriz) ou devido a condições de doença pré-existente prevenng acesso a punch. Aqui demonstramos um protocolo para a geração de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando um vector floxed-coletável único lentiviral que expressam constitutivamente as quatro factores. PBMCs recolhidos de fresco ou descongelado são expandidos durante 9 dias, tal como descrito em 10,11 de ácido ascórbico, meio contendo SCF, IGF-1, IL-3 e EPO antes de serem transduzidas com o lentivirus STEMCCA. As células são então plaqueadas em MEFs e ESC-como colónias podem ser visualizadas de duas semanas após a infecção. Finalmente, os clones seleccionados são expandidos e testados quanto a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Este protocolo é simples, robusto e altamente consistente, fornecendo uma metodologia fiável para a geração de iPSCs humanos prontamente acessível a partir de 4 ml de sangue.

Nós demonstramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de PBMCs, utilizando um vector lentiviral única. Figura 1A mostra uma representação esquemática do protocolo. O sangue é recolhido para um tubo CPT Vacutainer BD Preparação celular com citrato de sódio, e após a centrifugação, as células mononucleares pode ser recolhida a partir da interface entre o gel de poliéster e o plasma (buffy coat) (Figura 1B). As PBMCs isoladas são então ex...

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Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Biologia

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...