Name: generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector at JoVE.com

Dessa studier har finansierats delvis av NIH UO1HL107443-01 Award till GJM och GM.

1. Isolering och expansion av perifera mononukleära blodceller (PBMC) DAG 0 <ol><li> Rita 4 ml perifert blod i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat. Invertera röret 8 till 10 gånger och centrifugera vid 1.800 xg i 30 min vid rumstemperatur. Helst bör detta steg ske inom 2 timmar efter insamling. </li><li> Samla de mononukleära cellerna (MC) genom pipettering av buffy coat (cellskiktet mellan gelbarriär och plasma) i en steril 15 ml koniskt centrifugrör. Ta den tota...

<ol>
	<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li><li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li><li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34(-)+cells,+outweighing+the+contribution+of+CD34(+)+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples.">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li></ol>

Vi beskriver häri användandet av STEMCCA lentivirusvektorn att generera humana iPSCs från mononukleära celler som isolerats från några milliliter nyligen uppsamlat perifert blod. Protokollet kan även användas för att programmera frusna PBMC (erhålls direkt från buffy coat), en detalj av betydande praktiska konsekvenser vid användning donatorceller förvärvats från en avlägsen plats. Innan induktion av omprogrammering måste isolerade PBMC genomgå en kritisk utvidgning steg som gör en frisk förökande p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT cellberedning Tube med natriumcitrat </td><td> BD Biosciences </td><td> 362.760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 stamcellmedium </td><td> Kvalitet Biologisk </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12.440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11.330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout serumersättning </td><td> Invitrogen </td><td> 10.828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ANT-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15.140 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25.030 </td><td></td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror </td><td> Invitrogen </td><td> 11.140 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> MP Biomedicals </td><td> 190.242 </td><td></td></tr><tr><td> ASKORBINSYRA </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Dexametason </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> ^ H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES cellmarkör Prov Kit </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the stemcca lentiviral vector

Genom ektopiskt uttryck av fyra transkriptionsfaktorer, Oct4, Klf4,, Sox2 och cMyc kan humana somatiska celler omvandlas till en pluripotent tillstånd, genererar så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) 1-4. Patientspecifika iPSCs saknar de etiska problem som omger embryonala stamceller (ESC) och skulle kringgå eventuella avstötning. Därför har iPSCs fått stor uppmärksamhet för studier sjukdom modellering, screening av farmakologiska föreningar och regenerativa terapier 5. Vi har visat att generera transgenen-fria människor iPSCs från patienter med olika lungsjukdomar med en enda punktskattepliktiga polycistronisk Lentiviral kassett Stem Cell (STEMCCA) som kodar för Yamanaka faktorerna 6. Dessa IPSC linjer genererades från huden fibroblaster, den vanligaste cellen som används för omprogrammering. Normalt erhållande fibroblaster kräver en hud stansbiopsi följt av expansion av cellens i kultur för några passager. Viktigt, har ett antal grupper rapporterat omprogrammering av humana perifera blodceller i iPSCs 7-9. I en studie, var en Tet inducerbar version av STEMCCA vektorn användes 9, vilket krävde blodcellerna att samtidigt infekterad med en konstitutivt aktiv lentivirus kodar den omvända tetracyklin transaktivatorn. I motsats till fibroblaster, kan perifera blodceller samlas genom minimalt invasiva procedurer, avsevärt minskar det obehag och ångest hos patienten. En enkel och effektiv protokoll för omprogrammering blodkroppar med en konstitutiv enda punktskattepliktiga vektor kan påskynda tillämpningen av IPSC teknik genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället. Dessutom omprogrammering av perifera blodceller tillåter generering av iPSCs från personer som hudbiopsier bör undvikas (dvs. Avvikande ärrbildning) eller på grund av redan existerande sjukdomstillstånd preventing tillgång till stansbiopsier. Här visar vi ett protokoll för generering av mänskliga iPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC) med en enda floxed-punktskattepliktiga lentivirusvektor konstitutivt uttrycker 4 faktorer. Nyligen insamlade eller tinade PBMC expanderas under 9 dagar enligt 10,11 i medium innehållande askorbinsyra, SCF, IGF-1, IL-3 och EPO innan transducerade med STEMCCA lentivirus. Celler därefter ut på MEF och ESC-liknande kolonier kan visualiseras två veckor efter infektion. Slutligen, är utvalda kloner expanderas och testas för uttryck av de pluripotensbestämmande markörerna SSEA-4, Tra-1-60 och Tra-1-81. Detta protokoll är enkel, robust och mycket konsekvent, ger en tillförlitlig metod för generering av humana iPSCs från lättillgänglig 4 ml blod.

Vi visar en enkel och effektiv protokoll för generering av humana iPSCs från PBMC med användning av en enda lentivirusvektor. Figur 1A visar en schematisk representation av protokollet. Blodet uppsamlas i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat, och efter centrifugering, kan mononukleära celler samlas in från gränsytan mellan polyester gelén och plasman (buffy coat) (Figur 1B). De isolerade PBMC expanderas sedan i odling under 9 dagar. Figur 2 j...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector at JoVE.com

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Här visar vi ett enkelt och effektivt protokoll för generering av humana iPSCs 3 till 4 ml perifert blod med användning av en enda Lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lättillgängliga blodkroppar lovar att påskynda användningen av IPSC tekniken genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället.

Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera om musen Embryonala fibroblasts med en fyra transkriptionsfaktor, Doxycyklin inducerbara Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...