Name: artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Priyanka Subrahmanyam for personer diskussioner. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den amerikanske Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277, og P30 tumorimmunologi og Immunterapi Program til TJ Webb. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Cancer Institute eller National Institutes of Health.

1. Generering af AAPC <ol><li> Før tilsætning af proteiner til kugler, forberede alle reagenser og buffere: 0,1 M boratpuffer, 1X D-PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) Bead vaskebuffer (1X PBS + 5% human AB serum + 0,02% natriumazid) , Complete medium (RPMI-medium 100 mM natriumpyruvat, 10 mM ikke-essentielle vitaminer, 100 mM MEM vitamin opløsning, 1% 2-mercaptoethanol, 10 uM ciprofloxacin, 5% humant AB serum) MACS buffer (1 L PBS free af Ca2 + og Mg2 +, 5 g BSA, og 2 mmol EDTA). </li><li> Skyl 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy perler med 3 ml sterilt 0,1 M boratpuffer (borsyre og vand, pH 7,0-7,4) i en 5 ml klart borsilikatglas gevind hætteglas. </li><li> I et separat 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsættes 100 ug hCD1d-Ig dimer og 20 ug costimulerende molekyler (f.eks anti-CD28mAb) til 1 ml PBS w / o Ca2 + eller Mg2 +. </li> &lt;li&gt; Place perle indeholdende hætteglas på en magnet og aspireringsstilling boratpuffer fra perlerne. Tilføje protein blandingen fra trin 1,2 til hætteglas og erstatte låget. Bland straks ved at vende glasset, sætte hætten med parafilm, og sted på en rotator og inkuberes natten over ved 4 ° C. </li><li> Den næste dag, sted hætteglas på magnet og fjerne proteinblandingen mens omhyggeligt undgår perler. Vaskes perlerne ved tilsætning af 3 ml perle vaskebuffer (PBS med 5% AB-serum 0,02% natriumazid), og inkubering ved 4 ° C på en rotator i 5 min. Gentag to gange. </li><li> Perlerne kan opbevares i denne perle vask blanding. For at gøre funktionel AAPC, fjerne en lille prøve og tælle perlerne ved hjælp af et hæmacytometer. Check, at proteinerne stabilt lastes på perlerne ved farvning med antistoffer (ex. PE-konjugeret anti-muse IgG1) og udførelse af flow-cytometriske analyser. </li><li> At indlæse perler med antigen, fjern 5 x 10 7 perler, og der tilsættes en lille 1,5 ml hætteglas, skylles perlerne med 1 ml steril PBS. Resuspend vaskes perlerne med 1 ml sterilt PBS, og der tilsættes antigen; eksempel: Belastning med α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Bemærk: Mens, har vi ikke fundet nogen problemer med lipidopløselighed eller micelledannelse, bør lipider behandles i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Specifikt blev KRN7000 rekonstitueret i DMSO (1mg/ml) til disse undersøgelser. KRN7000 og andre glycolipid-antigener kan også opløses i 0,2 mg / ml PBS indeholdende 0,5% Tween-20 (sonikeres 2 timer. Ved 37 ° C). VIGTIGT-The AAPC nødvendigt at læsse i mindst 48-72 timer før anvendelse. </li></ol> 2. Isolering af CD161 + CD3 +-celler <ol><li> Collect perifere mononukleære blodceller (PBMC). For Ficoll densitetsgradientcentrifugering separation af lymfocytter fra en buffy coat eller leukoferese pack, fortyndes 1. Hepariniseret blod med et lige volumen af ​​1X PBS ved stuetemperatur. </li><li> Der tilsættes 15 ml Ficoll (opvarmet til stuetemperatur) til 50 ml koniske rør. Langsomt overlay25 ml af det fortyndede blod blandingen på toppen af ​​Ficoll. Der centrifugeres ved 2.000 rpm i 30 min ved stuetemperatur med bremsen. </li><li> Tag forsigtigt lymfocyt interface (hvid ring mellem medier og Ficoll) med en Pasteur-pipette og overføres til en ny 50 ml konisk rør. </li><li> Vask cellerne ved opfyldning af røret til 50 ml med PBS og centrifugering ved 1.500 rpm i 5 min. Supernatanten fjernes, og kombinere rør fra et enkelt individ til et enkelt rør og vaske de perifere mononukleære blodceller (PBMC) igen med 20 ml PBS. Derefter tælle PBMC og resuspender i en koncentration på 5 x 10 7 celler / ml i MACS buffer (1 L PBS uden Ca2 + og Mg2 +, 5 g BSA, og 2 mmol EDTA). </li><li> For at isolere T-celle-fraktionen, starter med 2 ml PBMC (10 8 celler), og der tilsættes 100 gl Pan T-celle berigelse opløsning fra EasySep humant T-celle Enrichment Kit. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. </li&gt; <li> Tilsæt 100 pi af magnetiske partikler til opløsningen, og der inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 10 min. Bringe slutvolumenet af opløsningsmiddel til 2,5 ml og placere røret i lilla magnet i 5 minutter. Hurtigt hæld CD3 + fraktionen til en 15 ml konisk rør. </li><li> Vask cellerne ved tilsætning af 5 ml koldt MACS buffer, tælle antallet af levedygtige celler, og fjerne en portion til FACS-farvning. </li><li> For at vælge de CD161 + celler, først opblande berigede T-celler i 980 pi iskold MACS buffer, tilsæt 10 ug anti CD161 mAb, og inkubér i køleskabet i 10 minutter. </li><li> Centrifuger cellerne ved 1.500 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Derefter rekonstituere cellepelleten i 800 pi MACS buffer. Der tilsættes 200 pi anti-mus IgG1-mikroperler og inkuber opløsningen i 10 minutter ved 4 ° C. </li><li> Under denne inkubering trin ækvilibrere en LS kolonne ved tilsætning af 3 ml MACS buffer. </li><li> Derefter vaskes cellerne ved centrifugering 1.500 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Resutilbringe de celler i 3 ml MACS buffer. Derefter fyldes cellerne i LS MACS udskilningssøjlen. Sørg for at undgå at skabe bobler ved pipettering langsomt. Søjlen skylles ved tilsætning af 3 ml MACS buffer. Gentag to gange. </li><li> Tilsæt 3 ml frisk MACS buffer og fjerne kolonnen fra magnet. Sted søjle til en 15 ml konisk rør. Indsæt stemplet og skubbe indhold for at opnå oprensede CD161 + CD3 + celler. Count NKT cell beriget fraktion. Du bør har 2-4 millioner celler. </li></ol> 3. AAPC-medieret NKT celleekspansion <ol><li> Nedsat co-kultur ved tilsætning af 10 6 berigede CD161 + CD3 + T-celler og 10 6 AAPC i 16 ml komplet medium (komplet medium + IL-2, 100 U / ml). Plate denne blanding ved tilsætning af 160 gl / brønd slutvolumen til en 96-brønds cellekultur behandlet polystyren, U-bundplade med lav afdampning låg. Udføre mediumudbytning hver 7. dag ved tilsætning af 80 gl frisk medium. </li><li> Harvestceller, tælle og udføre FACS farvning på dag 12-14. </li><li> De ekspanderede NKT-celler kan genudpladet som beskrevet ovenfor i trin 3.1, specifikt opblande 10 6 ekspanderede T-celler og 10 6 AAPC i 16 ml komplet medium. Plate denne blanding ved tilsætning af 160 gl / brønd til en 96-brønds U-bundplade. Fortsat opdatere cokultur medium hver 7. dag ved tilsætning af 80 gl frisk medium. </li><li> Det er bedst at fryse ekstra NKT-celler efter den anden runde af ekspansion (1 x 10 6 / cryovialet i 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) </li></ol> 4. Funktionel Test: AAPC-medieret stimulering af NKT-celler <ol><li> Nedsat 5x10 4 NKT celler / brønd med 5x10 5 AAPC i 200 pi slutvolumen (komplet medium) i 96-brønds U-bundplade. </li><li> Høst cellekultursupernatant for ELISA efter 24-48 timer. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

AAPC kan anvendes til undersøgelse af de grundlæggende krav for NKT-celleaktivering og det har potentielle kliniske værdi for ex vivo-ekspansion af NK-T-celler til adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev et af de første perle-baserede systemer, hvor biotinyleret murint MHC klasse I-peptid-enkeltkædede konstruktioner blev kombineret med biotinylerede costimulerende molekyler B7.1 og B7.2 via streptavidin til overfladen af latex mikrosfærer 14, 15. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt til at stimulere antigenspecifikke T-celler fra transgene mus. Desuden, eftersom denne fremgangsmåde anvender et enkeltkædet MHC-peptidkomplekset for at sikre homogen belastning af MHC-molekyler De enkelte mål peptidantigen kræve en ny transfektion til ekspression af det ønskede enkeltkædede MHC-peptid-komplekset, hvilket begrænser anvendelsen af ​​det fremgangsmåde. Vigtigere er det, Dr. Schneck gruppe pioner perlen based-AAPC ved at udvikle en anden ikke-cellulær perle baserede AAPC, Fremstillet ved kobling af HLA-Ig, signal 1, og anti-CD28, signal 2, på magnetiske kugler. HLA-Ig, en unik multimer form af HLA fusioneret til et immunglobulin molekylær stillads 16, 17 er udviklet af hans gruppe. Efterfølgende udviklede de MHC-Ig baseret AAPC, som har vist sig effektivt at udvide CMV og MART-1-specifik CTL 18. Her har vi vist, at CD1d-Ig-baserede AAPC kan bruges til at udvide funktionelle NKT-celler. Et studie har anvendt et lignende system til at undersøge den fysiske interaktion af NK-celler med CD1d 19. Især har vi designet et kunstigt antigenpræsenterende celle, som kan tilpasses ethvert krav, vi finder nødvendige for optimal NKT celleproliferation. Den AAPC ekspansion metode giver en enkel og pålidelig metode til at udvide og berige humane NKT-celler. Vores AAPC kan modificeres systematisk at vurdere rollen af ​​en række potentielle costimulerende molekyler og vurdere deres rolle på NKT-celle spredtion og funktion. Således AAPC et rimeligt alsidig teknologi anvendes til induktion og udvide NKT-celler. Frembringelsen af ​​aAPCs tager mindre end en uge og er egnet til fremstilling af store mængder perler. En kritisk trin i frembringelse af AAPC er at bekræfte, CD1d-Ig stabilt er immobiliseret på overfladen af ​​kuglerne, og for at vurdere deres funktion at sikre konsistens fra batch til batch. En potentiel begrænsning ved systemet er, at der ikke er en mekanisme til at slå stimulation, bortset fra mekanisk fjernelse af perlerne. Specifikt indgrebet af T-cellereceptoren (TCR) med antigenet: CD1d/MHC komplekset typisk genererer den immunologiske synapser i forståelse med accessoriske / adhæsionsmolekylerne, som kan resultere i induktion af hæmmende eller undertrykkende faktorer på både T-celle og antigen-præsenterende celle. I AAPC systemet, kan disse faktorer være opreguleret af T-cellen, men vulsten vil ikke udtryk for beslægtede liganderfor disse receptorer. Desuden er CD4 + NKT-celler vist sig at undertrykke antitumor-reaktioner i mus og mennesker, derfor er det muligt, at ikke-selektive aktivering af alle NKT-celler (dvs. global stimulering med α-GalCer) eller aktivering af den forkerte delmængde kan medføre uønskede immunologiske resultater. Derfor skal man fænotypisk og funktionelt karakterisere AAPC-ekspanderet NKT cellepopulation. Som vist i figur 4, har vi fundet, at stimulering med α-GalCer-loaded AAPC udtrykker anti-CD28 kan resultere NKT-celler, der producerer Th1, Th2-og Th17 type cytokiner. Murine undersøgelser har rapporteret, at udfordringen med IL-33, et for nylig identificeret cytokin, resulterede i øgede niveauer af cirkulerende inflammatoriske cytokiner, såsom IL-5 og IL-13. Behandling af NKT-celler med IL-33 øget deres cytokinproduktion 20. IL-33 er en specifik ligand for ST2 og det er blevet vist, at opløselig ST2 can blok IL-33 signalering. Således, som et eksempel på en fremtidig anvendelse, kan AAPC udtrykker ST2 genereres og anvendes til at bestemme, om man selektivt kan inhibere produktionen af ​​Th2-cytokiner, samtidig med at inducere Th1-cytokin-sekretion af NKT-celler. Det er også blevet rapporteret, at intravenøs injektion af Kb-udtrykkende AAPC i C57BL / 6 mus resulterede i reduceret lunge metastase af tumoren 21. Vigtigt, disse data, at AAPC trafik til lungen og er i stand til at aktivere effektor-T-celledelmængder. Derfor kunne man generere flere typer af AAPC og undersøge samspillet mellem antigen specifikke T-celle delmængder. For at opsummere, disse undersøgelser viser, at CD1d-Ig-baserede AAPC kan anvendes til at erstatte normal cellulær APC, og har på muligheden for at forbedre de nuværende kliniske tiltag for NKT cellebaseret-adoptiv immunterapi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human T Cell Enrichment Kit </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19.051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 human mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550.968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18.002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI rekombinant opløselig Dimert Mouse CD1d: Ig fusionsprotein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302.914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy perler </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> A-galactosylceramid (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640-medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke-essentielle aminosyrer </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamin Solution </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342.904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (klon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (klon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123.510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-muse-IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556.650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-muse-IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407.105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, no calcium, no magnesium </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Amerikansk Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431.788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.043 </td><td></td></tr><tr><td> Humant AB serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 til 687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polystyren rundbundede rør </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glas prøvehætteglas med Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Lille (03-343-6A) Stor (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Naturlige dræber T (NKT) celler er en unik undergruppe af T-celler, der viser markører der er karakteristiske for både naturlig dræber (NK)-celler og T-celler 1. Ulig klassiske T-celler, genkender NKT-celler lipid-antigen i forbindelse med CD1-molekyler 2. NKT-celler udtrykker en invariant TCRα kæde omlejring: Vα14Jα18 i mus og Vα24Jα18 hos mennesker, som er associeret med Vp-kæder af begrænset diversitet 3-6, og omtales som kanoniske eller invariant NKT (i NKT) celler. Ligesom konventionelle T-celler, NKT-celler udvikler sig fra CD4-CD8-thymus-precursor-T-celler efter passende signalering ved CD1d 7. Potentiale til at udnytte NKT-celler til terapeutiske formål er signifikant forøget med evnen til at stimulere og øge humane NKT-celler med α-galactosylceramid (α-GalCer) og en række cytokiner 8. Vigtigt, disse celler bevarede deres oprindelige phenotype, secernerede cytokiner og vises cytotoksiske funktion mod tumorcellelinier. Således ex vivo ekspanderede NKT-celler forbliver funktionelle og kan anvendes til adoptiv immunterapi. Imidlertid har NKT cellebaseret-immunterapi blevet begrænset af anvendelsen af ​​autologe antigenpræsenterende celler, og mængden og kvaliteten af ​​disse stimulatorceller kan variere betydeligt. Monocyt-afledte DC fra cancerpatienter er rapporteret at udtrykke reducerede niveauer af costimulerende molekyler, og producerer mindre inflammatoriske cytokiner 9,10. Faktisk har murine DC stedet for autolog APC blevet anvendt til at teste funktionen af NKT-celler fra CML-patienter 11. Imidlertid kan dette system kun anvendes til in vitro testning, da NKT-celler ikke kan udvides med murine DC og derefter anvendes til adoptiv immunterapi. Således kunne et standardiseret system, der er baseret på kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) producerer de stimulerende virkninger af DC uden faldgruberne i allo-eller xenogent ceLLS 12, 13. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse af CD1d-baseret AAPC. Eftersom indgrebet af T-cellereceptoren (TCR) efter CD1d-antigenkomplekser er et grundlæggende krav for NKT celleaktivering, antigen: CD1d-Ig-komplekser tilvejebringe en pålidelig fremgangsmåde til at isolere, aktivere og udvide effektor NKT cellepopulationer.

Heri beskrives en fremgangsmåde til generering CD1d-Ig-baserede AAPC, ved kovalent kobling af CD1d-Ig og anti-CD28 mAb til magnetiske perler for at stimulere NKT-celler som en standardiseret fremgangsmåde til opformering af NKT-celler (figur 1). Først en skal påvise, at CD1d-Ig-fusionsproteiner stabilt immobiliseres på overfladen af ​​de magnetiske perler. Som vist i figur 2A, CD1d-Ig og anti-CD28-antistoffer begge blev udtrykt på overfladen af de magnetiske perler. For at undersøge den stimulerende kapacitet AAPC, vi co-dyrkede NKT cellehybridomer med AAPC natten, høstede kultursupernatanter og målte IL-2-produktion ved ELISA. Vi fandt, at CD1d-Ig-baserede AAPC var i stand til at stimulere NKT cellehybridomer på niveauer lig med eller højere end deres cellulære modstykker (figur 3, data ikke vist). Interessant vi fandt, at vores murine NKT-celle-hybridomaer er stimuleret af human CD1d-baseret AAPC (Figuren 2B), som giver enkel metode til at teste hvert parti af AAPC. Next, forsøgte vi at påvise formering potentiale af AAPC, blev således humane T-celler isoleret fra det perifere blod. Først CD161 + CD3 + T-celle-fraktion blev beriget ved magnetisk perle separation. Derefter blev T-celler stimuleret to gange om ugen med α-GalCer-loaded AAPC. Vigtigt er det, vi har fundet, at selv med en relativt lav initial NKT cellepopulation (0,03%), var vi i stand til at ekspandere cellerne til ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (figur 3). Vi har udvidet NKT-celler fra PBMC af mange raske frivillige og cancerpatienter, og har fundet, at α-GalCer loaded AAPC kunne udvide NKT-celler population i begge grupper. Især udvidelseshastigheden var meget donor afhængige. Som forventet højere den oprindelige population af Vα24 +-celler, jo større procentdel af ekspansion. Desudennår der anvendes et udgangsmateriale population på 2 millioner celler CD161 + CD3 + T-celler, kan man opnå&gt; 10 7 celler efter to runder af vækst (tabel 1). Ca. 80-90% af de ekspanderede NKT-celler er CD4 +, ~ 5% CD8 +, og de ​​resterende er formentlig CD4-CD8-dobbelt negative NKT-celler. Disse udvidede NKT-celler kan anvendes til funktionelle undersøgelser som vist i figur 4A-C. Vi har konstateret, at vores ex vivo udvidet NKT-celler tiden kunne α-GalCer stimulation og er potente producenter af IL-17A, TNF-α og IFN-γ. Det skal bemærkes, at hvis den indledende T-celle berigelse population er lav, og man er i stand til at udføre den anden CD161 berigelsestrin, kan AAPC-medieret udvidelse ikke giver de forventede resultater (se figur 4D, Donor 1). Men hvis andelen af ​​cirkulerende NKT-celler er højere end 0,1%, bør man stadig kunne opnå en markant udvidelseaf I NKT-celler. Kollektivt disse data, at CD1d baserede-AAPC kan anvendes til effektivt at udvide og stimulere primære humane NKT-celler. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk diagram over CD1d: Ig-baserede aAPCs ekstracellulære dele af den CD1d molekylet er fusioneret til den konstante region af en immunoglobulin tung kæde-protein adskilt af en kort aminosyrelinker. Disse molekyler kan let fyldes med lipid-antigener, såsom α-GalCer, blot ved at inkubere dem med et overskud af lipidet af interesse. AAPC blev fremstillet ved kobling CD1d-Ig og anti-CD-Abs til magnetiske kugler. I dette system er CD1d-Ig anvendes til at tilvejebringe det beslægtede antigen-specifikt signal via TCR-og anti-CD28 mAb indeholder det samstimulerende signal. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. . FACS-farvning af overfladeproteiner på aAPCs A) aAPCs blev testet for tilstedeværelsen af CD1d: IgG-dimer (via farvning med PE-konjugeret anti-muse IgG1) og anti-CD28-antistof (under anvendelse af FITC-konjugeret anti-muse-IgG2a) . Åbne histogrammer viser isotypekontrol, fyldte histogrammer repræsenterer de angivne antistoffer. CD1d-Ig udtrykker AAPC kan stimulere IL-2-produktion af NKT-celler. B) Vα14 + muse NKT-celle-hybridoma, DN32.D3, blev dyrket sammen med enten medium, opløseligt antigen (α-GalCer), losset AAPC eller α-GalCer-loaded AAPC. Kultursupernatanter blev høstet og standard-sandwich-ELISA blev anvendt til måling af IL-2 produktion. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figur 3. Ekspansion af NKT-celler ved CD1d-Ig-overtrukne kunstige antigenpræsenterende celler. (A) Primær CD3 + CD161 + dobbelt positive celler blev isoleret fra PBMC&#39;er ved hjælp af magnetisk separation. De sorterede celler blev stimuleret med α-GalCer loaded, CD1d-Ig coated AAPC i 14 dage. Cellerne blev farvet for Vα24 og Vβ11 følgende AAPC stimulation. (B) Primær human NKT-celle medieret lyse af en B celle lymfom linje. C1R-CD1d celler inkuberet med NKT-celler i de angivne forhold i nærvær eller fravær af antigen, a-GalCer (100 ng / ml) i 96-brønds U-bundede plader i 20-24 timer. NKT-celle medieret cellelysis blev vurderet ved ved standard 51Cr-release assay. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figur 4. Cytokinprofiler af AAPC-ekspanderede NKT-celler. </strong&gt; Efter stimulering med α GalCer loaded AAPC i to uger, de ekspanderede NKT-celler (1 × 10 5 / brønd) blev dyrket sammen med opløseligt α-GalCer, PMA / ionomycin anti-CD3/28 mikroperler eller α-GalCer loaded AAPC (2 × 10 5 / brønd) i 48 timer. (A) IL-17A, (B) TNF-α, og (C) IFN-γ-produktion blev målt ved hjælp af standard cytokin ELISA. De viste data er netto cytokinproduktion efter fradrag af de negative kontroller (medier og tomme perler). (D) Primære T-celler blev isoleret fra PBMC med magnetisk perle separation. De sorterede celler blev stimuleret i to uger med angivelsen a-GalCer belastet-AAPC. Cellerne blev farvet ved anvendelse af Ab&#39;er specifikke til Vα24 + og Vβ11 + og analyseret ved flowcytometri.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Her beskriver vi en fremgangsmåde til aktivering og udvide humane NKT-celler fra bulk T-cellepopulationer med kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC). Anvendelsen af ​​CD1d-baseret AAPC tilvejebringer en standardiseret fremgangsmåde til generering af et stort antal funktionelle NKT-celler.

Kunstig antigenudvisende celle (AAPC) medieret aktivering og ekspansion af naturlige dræberceller T-celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse af<em&gt; Tornerose</em&gt; Artificial og antigen-præsenterende celler til genetisk at modificere T-celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...