Name: artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

저자는 도움이 토론을 Priyanka Subrahmanyam 감사드립니다. 저자는 금융 관심을 경쟁 없습니다. 이 작품은 미국 암 학회, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 및 P30 종양 면역학과 TJ 웹에 Immunotherapy 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. aAPC의 생성 <ol><li> 구슬에 단백질을 추가하기 전에 모든 시약 및 버퍼 준비 : 0.1M Borate 버퍼를, 1X D-PBS (NO 칼슘 2 +와 MG 2 +), 비드 워시 버퍼 (1X PBS 5% 인간 AB 혈청 + 0.02 % 나트륨 azide) , 전체 매체 (RPMI 매체 100 MM 나트륨 pyruvate, 10 MM 중요하지 않은 비타민 솔루션, 100 MM 가상 비타민 솔루션, 1 % 2 - 메르 캅토 에탄올, 10 μM의 * 시프로플록사신, 5 % 인간 AB 혈청), 맥 버퍼 (1 L PBS 무료 칼슘 2 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> 5 ML 명확한 붕규산 유리 스레드 유리 병 3 ML 멸균 0.1 M Borate 버퍼 (붕산과 물, 산도 7.0-7.4) 1 개 ML Dynabeads M-450 에폭시 구슬을 씻어. </li><li> 1 ML PBS w / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 + : 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 100 μg hCD1d-IG 이량 체 및 20 μg의 costimulatory 분자 (안티 - CD28mAb 예를 들어)을 추가합니다. </li> &lt;리&gt; 장소 구슬 구슬의 자석 및 기음 borate 버퍼에 유리 병을 포함. 단계 1.2에서 유리관에 단백질 혼합물을 추가하고 캡을 교체하십시오. 반전 유리 병에 의해 즉시 혼합, 회전하는 것에 parafilm과 캡, 및 장소를 커버와 4 ° C.에서 하루 아침에 품다 </li><li> 조심스럽게 구슬을 피하면서 다음 날, 장소 유리 자석에 약병하고, 단백질 혼합물을 제거합니다. 3 ML 비드 세척 버퍼를 (PBS와 5퍼센트 AB 혈청 0.02 %의 나트륨 azide)을 추가, 5 분의 회선 근에 ° C 4에 잠복기로 구슬을 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 구슬이 구슬 세탁 혼합물에 저장 할 수 있습니다. 기능 aAPC을 만들려면, 작은 나누어지는를 제거하고 hemacytometer를 사용하여 구슬을 계산합니다. 단백질이 안정적으로 항체 (예 : PE-복합 안티 - 마우스 IgG1)으로 얼룩 및 흐름 cytometric 분석을 수행하여 구슬에로드되어 있는지 확인합니다. </li><li> 항원과 구슬을로드하려면, 5 X 10 7 구슬을 제거하고 작은 1.5 ML의 유리관에 추가, 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻어. Resuspend 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻고 및 항원 추가, 예 : α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml)을로드합니다. * 참고 : 우리는 지질 용해도 또는 마이셀 형성에 문제를 발견하지 않은 있지만, 지질은 제조업체의 권장 사항에 따라 처리해야합니다. 특히, KRN7000은 이러한 연구에 DMSO (1mg/ml)에서 재구성되었습니다. KRN7000 및 기타 glycolipid 항원은 0.2 MG / ML PBS는 0.5 %를 포함에 용해 될 수 십대 초반 - 2​​0 (2 시간을 sonicate. 37 ° C에서). 중요 - aAPC는 사용하기 전에 적어도 48-72 시간에로드해야합니다. </li></ol> 2. CD161 + 3 번 CD + 세포의 분리 <ol><li> 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 수집합니다. 버피 코트 나 leukopheresis 팩에서 림프구의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리 분리를 들어, 첫 번째 방 온도에서 1X PBS의 동일한 볼륨으로 heparinized 혈액을 희석. </li><li> Ficoll 15 ML (객실 온도로 예열) 50 ML 원뿔 튜브에 추가합니다. 천천히 오버레이25 Ficoll 상단에 희석 혈액 혼합물의 ML. 브레이크 해제로 실온에서 30 분에 2,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 파스퇴르 피펫으로 림프구 인터페이스 (미디어 및 Ficoll 사이에 하얀 링)을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> PBS로 50 ML에 튜브를 작성하고 5 분에 1,500 rpm으로 centrifuging하여 세포를 씻으십시오. 표면에 뜨는을 취소하고 단일 관에 한 개인의 튜브를 결합, 20 ML PBS로 다시 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 씻는다. 그런 다음 PBMC를 계산 5 X 10 7 세포 / 맥 버퍼에 ML의 농도에 resuspend (CA 2 단계 중 1 L PBS 무료 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> T 세포 분획을 분리하기 위해, PBMC (10 8 셀) 2 ML로 시작하고 EasySep 인간 T 세포 농축 키트의 팬 T 세포 농축 솔루션 100 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 알을 품다. </lI&gt; <li> 또 다른 10 분 동안 실온에서 솔루션과 부화 자기 입자의 100 μl를 추가합니다. 2.5 용매 ML의 최종 볼륨을 데려와 5 분의 보라색 자석에 튜브를 놓습니다. 빠르게 15 ML 원뿔 튜브에 3 번 CD + 일부를 부어. </li><li> 5 ML 추위 맥 버퍼를 추가하여 세포를 씻으, 가능한 세포의 수를 계산하고, FACS의 착색에 나누어지는을 제거합니다. </li><li> 980 μl 얼음 차가운 맥 버퍼에 CD161 + 세포 먼저 resuspend 농축 T 세포를 선택하려면, 10 μg 항 CD161적인 mAb를 추가하고 10 분 동안 냉장고에 품다. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm으로 세포를 원심 분리기. 맥 버퍼 800 μl의 다음 reconstitute 세포 펠릿. 안티 - 마우스 IgG1 microbeads 200 μl를 추가하고 4시 10 분에 대한 솔루션을 품다 ° C. </li><li> 이 부화 단계에서, 3 ML 맥 버퍼를 추가하여 LS 열을 평형. </li><li> 다음 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm을 centrifuging하여 세포를 씻어. 열매3 ML 맥 버퍼에 셀을 보냅니다. 그런 다음 LS 맥 분리 칼럼으로 세포를 피펫. 천천히 pipetting하여 거품을 발생하지 않도록해야합니다. 맥 버퍼 3 ML을 추가하여 열을 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 3 ML 신선한 맥 버퍼를 추가하고 자석의 열을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 장소 열. 플런저를 삽입하고 정화 CD161 + 3 번 CD + 세포를 얻기 위해 내용을 밀어. 카운트 NKT 세포에는 소수점으로 값진 경험을했습니다. 당신은 2-4000000 세포가 있어야합니다. </li></ol> 3. aAPC로 인한 NKT 세포 확장 <ol><li> 16 ML 전체 매체 (전체 중간 + IL-2, 100 U / ML)에서 10 6 강화 CD161 + 3 번 CD + T 세포와 10 6 aAPC을 추가하여 공동 문화를 설정합니다. , 96 잘 조직 문화 취급 폴리스티렌으로 낮은 증발 뚜껑이있는 U-바닥 판을 160도 최종 / μl 볼륨을 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 하루 매체 교환을 수행합니다. </li><li> 수확세포는, 계산하고, 일 12-14에 FACS의 착색을 수행합니다. </li><li> 확장 NKT 세포는 특히 16 ML 완전한 매체에 10 6 확장 된 T 세포와 10 6 aAPC을 resuspend, 위의 단계 3.1에 설명 된대로 replated 할 수 있습니다. μl / 잘 96도 U-바닥 판 160를 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 일 coculture 매체를 새로 고침 계속합니다. </li><li> 이 확장의 두 번째 라운드에 따라 추가 NKT 세포를 동결하는 것이 가장 좋습니다 (1 ML-5퍼센트 DMSO / 95% FBS 1 X10 6 / cryovial.) </li></ol> 4. 기능 테스트 : NKT 세포 aAPC로 인한 자극 <ol><li> 5x10 4 NKT 세포를 설정 / 잘 96도 U-바닥 판 200 μl 최종 볼륨 (전체 매체)에 5x10 5 aAPC을 갖추고 있습니다. </li><li> 24-48 시간 후 엘리사에 대한 수확 세포 배양 표면에 뜨는. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

aAPC는 NKT 세포 활성화를위한 기본 요구 사항을 연구하는 데 사용하며 입양 immunotherapy에 대한 NK T 세포의 전 생체 확장에 대한 잠재적 인 임상 적 가치를 가지고 할 수 있습니다. Mescher 외이 있습니다. 라텍스 마이크로 14, 15의 표면에 biotinylated costimulatory 분자 streptavidin을 통해 B7.1와 B7.2와 결합 된 최초의 구슬 기반 시스템 중 하나 인 biotinylated 손쥐 MHC 클래스 I-펩타이드 단일 사슬 구조를 설명했다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 형질 전환 생쥐에서 항원에 특정한 T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 MHC 분자의 균일 한로드을 보장하기 위해 단일 ​​체인 MHC-펩타이드 복합를 사용하고 있기 때문에 또한, 각 대상 펩타이드 항원 따라서의 일반성을 제한, 원하는 단일 체인 MHC-펩타이드 복잡한 표현을위한 새로운 transfection를 요구 접근. 중요한 것은, 박사 Schneck의 그룹은 또 다른 비 세포 비드 기반 aAPC를 개발하여, 비드 기반 aAPC을 개척, 자기 구슬에 HLA-IG, 신호 1, 항 CD28, 신호 2, 커플 링으로했습니다. HLA-IG, 면역 글로불린 분자 골격 16, 17 융합 HLA의 고유 한 multimeric 양식은 자신의 그룹에 의해 개발되었다. 그 후, 그들은 효과적으로 CMV와 마트-1 특정 CTL 18 확대 표시 한 MHC-IG 기반 aAPC을 개발했습니다. 여기, 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC가 작동 NKT 세포를 확장하는 데 사용할 수있는 증명하고있다. 한 연구는 CD1d 19과 NK 세포의 물리적 상호 작용을 조사하기 위해 비슷한 시스템을 사용하고 있습니다. 특히, 우리는 최적의 NKT 세포 증식에​​ 필요한 찾을 수 요구 사항에 적용 할 수 있습니다 인공 항원 제시 세포를 설계했습니다. aAPC 확장 방법은 인간의 NKT 세포를 확대하고 풍부하게하는 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 우리 aAPC는 체계적으로 잠재적 인 costimulatory 분자의 패널의 역할을 평가하고 NKT 세포 prolifera에서 자신의 역할을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다기 및 기능. 따라서, aAPC는 NKT 세포를 유도하고 확장에 유용한 강력한 다목적 기술을 나타냅니다. aAPCs의 세대 미만의 주 소요 구슬의 대량 생산에 적합합니다. 그러나 aAPC을 생성에 중요한 단계는 CD1d-IG는 안정적 구슬의 표면에 고정되어 있는지 확인하고 일괄 배치에 일관성을 보장하기 위해 자신의 기능을 평가하는 것입니다. 시스템의 잠재적 인 제한은 구슬의 기계적 제거 이외의 자극을 해제하는 장소에서 메커니즘이 없을 것입니다. 특히, 항원과 T 세포 수용체 (TCR)의 참여 : CD1d/MHC 단지는 일반적으로 T 세포와 모두에서 억제 또는 진압 요인의 유도 될 수 있습니다 액세서리 / 접착 분자와 협력의 면역 시냅스를 생성 항원이 세포를 제시. aAPC 시스템에서 이러한 요소는 T 세포에 의해 upregulated 될 수도 있지만 구슬은 같은 종류의 리간드를 표현하지 않습니다이 수용체에. 또한 CD4 + NKT 세포는 마우스와 인간의 antitumor 응답을 억제하기 위해 표시되었습니다, 따라서 모든 NKT 세포 (α-GalCer있는 즉, 글로벌 자극) 또는 잘못된 부분 집합의 활성화 nonselective 활성화가 원치 않는 면역이 발생할 수 가능성이 있습니다 결과. 따라서, 하나는 phenotypically하고 기능적으로 aAPC 확장 된 NKT 세포 인구를 특성화해야합니다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, 우리는 안티 CD28을 표현 α-GalCer -로드 aAPC과 자극이 Th2 Th1을 생산하는 NKT 세포, 그리고 Th17 형 크린 시토 킨을 발생할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 손쥐 연구 IL-33, 최근에 확인 시토 킨과 도전 이러한 IL-5 및 IL-13 등의 염증성 크린 시토 킨을 순환의 증가 수준으로 이어진보고했습니다. IL-33와 NKT 세포 치료는 시토 킨 생산 20 강화했습니다. IL-33은 ST2에 대한 특정 리간드이며, 그 용해 ST2 CA 보여왔다N 블록 IL-33 신호. 따라서, 미래의 응용 프로그램의 예를 들어, aAPC 표현 ST2가 생성 및 NKT 세포의 Th1 시토 킨 분비를 유도하면서 하나가 선택적으로 Th2 크린 시토 킨의 생산을 억제 할 수 있는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 또한보고되었습니다 그 IV 주입 KB - 표현 C57BL에 aAPC을 / 6 쥐가 종양이 21 감소 폐 전이있었습니다. 중요한 것은, 이러한 데이터는 폐에 해당 aAPC 트래픽을 입증하고 효과기 T 세포 하위 집합을 활성화 할 수 있습니다. 따라서, 하나는 aAPC의 여러 유형을 생성하고 항원 특정 T 세포의 하위 집합 사이의 상호 작용을 조사 수 있습니다. 요약하면,이 연구 CD1d-IG 기반 aAPC은 정상적인 세포 APC를 대체하는 데 사용할 수 있다는 것을 입증하고, NKT 세포 기반 입양 immunotherapy에 대한 현재 임상 접근법을 향상 할 수있는 잠재력이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE 생명 과학 </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 T 세포 농축 키트 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 19,051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 인간적인 mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 자석 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 18,002 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> 이량 체 XI 재조합 가용성식이 Dimeric 마우스 CD1d : IG의 융합 단백질 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 안티 CD28적인 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 에폭시 구슬 </td><td> 생명 기술 </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> 알파 galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 매체 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 비타민 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * 시프로플록사신 </td><td> 알렉시스의 Biochemicals </td><td> 380-288 - G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (복제 C15) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (복제 C21) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE 방지 마우스 IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC 안티 - 마우스 IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, 아니 칼슘, 마그네슘 없음 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 AB 세럼 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake 튜브 회전하는 것 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-687 - 10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD 매 5 ML의 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-959 - 1A </td><td></td></tr><tr><td> 모자와 Wheaton의 유리 샘플 병 </td><td> 피셔 과학 </td><td> (03-343 - 6E) 대형 (03-343 - 6A) 소형 </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

자연 킬러 T (NKT) 세포는 자연 킬러 (NK) 세포와 T 세포 하나 둘의 특성 마커를 표시 T 세포의 고유 한 하위 집합입니다. 고전 T 세포와는 달리 NKT 세포는 CD1 분자 2의 맥락에서 지질 항원을 인식하고 있습니다. 쥐 Vα14Jα18 및 제한된 다양성 3-6의 Vβ 체인과 관련된 인간에 Vα24Jα18, 그리고 표준 또는 불변 NKT (I NKT) 세포라고합니다 : NKT 세포는 불변 TCRα 체인 다시 정리하기를 표현한다. 기존의 T 세포와 마찬가지로, NKT 세포는 CD1d에 7 적절한 신호에 따라 CD4 - CD8-thymic 전구체 T 세포에서 개발할 수 있습니다. 치료 목적으로 NKT 세포를 활용 할 수있는 가능성이 크게 α-Galactosylceramide (α-GalCer)과 크린 시토 킨 8 다양한 인간의 NKT 세포를 자극하고 확장 할 수있는 능력 증가했다. 중요한 것은, 이러한 세포는 원래 phenotyp을 유지E, 분비의 크린 시토 킨, 그리고 종양 세포 라인에 대한 표시 세포 독성 기능입니다. 따라서, 예 생체 확장 NKT 세포는 기능 유지와 입양 immunotherapy에 사용할 수 있습니다. 그러나, NKT 세포 기반 immunotherapy는 autologous 항원 제시 세포의 사용에 의해 제한되어 이러한 stimulator 세포의 수량 및 품질이 실질적으로 다를 수 있습니다. 암 환자의 단핵 세포 - 파생 DC는 costimulatory 분자의 감소 수준을 표현하고 9,10 이하 염증성 크린 시토 킨을 생산하는 것으로보고되었습니다. 사실, 오히려 autologous APC보다 손쥐 DC는 CML 환자 11 일부터 NKT 세포의 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다. NKT 세포는 손쥐 DC에 의해 확장하고 입양 immunotherapy 사용할 수 없습니다 수 있기 때문에 그러나,이 시스템은 체외 테스트에 사용할 수 있습니다. 따라서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 의존 표준화 된 시스템은여 또는 xenogeneic CE의 함정없이 DC의 자극 효과를 생산할 수재편 12, 13. 여기, 우리는 CD1d 기반 aAPC을 생성하는 방법을 설명합니다. CD1d-IG 단지는 신뢰할 수있는 방법 격리 활성화하고, 이펙터 NKT 세포 인구를 확장 할 수를 제공합니다 CD1d-항원 단지로 T 세포 수용체 (TCR)의 참여는 NKT 세포의 활성화, 항원의 기본 요구 사항 때문입니다.

여기에 우리는 NKT 세포 (그림 1)의 전파를위한 표준화 된 방법으로 NKT 세포를 자극하는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD28적인 mAb의 공유 결합 커플 링에 의한 CD1d-IG 기반 aAPC를 생성하는 방법을 설명합니다. 첫째, 하나는 CD1d-IG 융합 단백질이 안정적으로 자기 구슬의 표면에 고정되어 있는지 입증해야합니다. 그림 2A, CD1d-IG 및 안티 CD28에 표시된 항체는 자기 구슬의 표면에 표현 된 두. aAPC의 stimulatory 용량을 조사하기 위해, aAPC 밤, 수확 문화 supernatants와 엘리사에 의해 측정 IL-2 생산과 우리가 공동 교양 NKT 세포 hybridomas. 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC는 (그림 3, 데이터가 표시되지 않음)와 같거나 자신의 휴대 전화 대응보다 높은 수준에서 NKT 세포 hybridomas을 자극 할 수 사실을 발견했습니다. 흥미롭게도, 우리는 마우스 NKT 세포 hybridomas은 인간 CD1d 기반 aAPC (FI에 의해 자극 것을 발견aAPC의 각 배치 테스트를위한 간단한 방법을 제공합니다 gure 2B). 다음, 우리는 aAPC의 전파 가능성을 보여 모색, 따라서 인간의 T 세포는 말초 혈액에서 분리되었습니다. 먼저 CD161 + 3 번 CD + T 세포 비율은 자기 비드 분리하여 풍부하게되었다. 그런 다음, T 세포는 α-GalCer -로드 aAPC과 함께 격주 자극했다. 중요한 것은, 우리는 상대적으로 낮은 초기 NKT 세포 인구 (0.03 %)로, 우리는 ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (그림 3)에 셀을 확장 할 수 사실을 발견했습니다. 우리는 건강한 자원 봉사자와 암 환자의 PBMC에서 NKT 세포를 확대하고 α-GalCer로드 aAPC가 모두 그룹에서 NKT 세포 인구를 확장 할 수있었습니다 것으로 나타났습니다. 특히, 확장 속도는 매우 기증자가 의존했다. 예상 Vα24 + 세포의 높은 초기 인구, 확장의 큰 비율입니다. 또한,2,000,000 셀의 시작 인구를 사용하는 경우 CD161 + 3 번 CD + T 세포는 하나가 확장의 두 발 (표 1) 후&gt; 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 확장 된 NKT 세포의 약 80~90%는 +, ~ 5% CD8는 +, 나머지는 아마 CD4 - CD8 더블 부정적인 NKT 세포 아르 CD4 있습니다. 그림 4A-C와 같이 이러한 확장 된 NKT 세포는 기능 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 우리의 전 생체는 NKT 세포는 α-GalCer의 자극에 반응 유지하고 IL-17A, TNF-α와 IFN-γ의 강력한 PD가 확대 것으로 나타났습니다. 그것은 초기 T 세포 농축 인구가 낮은 한 두 번째 CD161 농축 단계를 수행 할 수없는 경우 aAPC로 인한 확장이 예상 결과를 (그림 4D, 기부자 1 참조) 포기하지 않을 수 있다는 것을 알아야한다. 순환 NKT 세포의 비율이 0.1 %보다 높은 경우에는, 하나는 여전히 상당한 확장을 얻을 수 있어야합니다내가 NKT 세포. 이하,이 데이터는 CD1d 기반 aAPC이 효과적으로 확장하고 기본 인간의 NKT 세포를 자극하는 데 사용할 수있는 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> 1 그림. CD1d의 개략도 : IG 기반 aAPCs CD1d 분자의 세포 부분은 짧은 아미노산 링커로 구분하여 면역 글로불린 중쇄 단백질의 일정한 영역에 융합되어 있습니다. 이 분자는 쉽게 간단 관심 지질의 과잉으로 그들을 잠복기에 의해, 이러한 α-GalCer와 같은 지질 항원과로드 할 수 있습니다. aAPC는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD 배에 힘을 결합하여 만들어졌다. 이 시스템에서 CD1d-IG는적인 mAb는 costimulatory 신호를 제공하는 TCR 및 안티 CD28을 통해 같은 종류의 항원에 특정한 신호를 제공하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="4.25in" fO : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot;/ &quot;를 / files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot;&gt; 그림 2. . IgG 이량 체 (PE-복합 안티 - 마우스 IgG1과 착색을 통해)뿐만 아니라 안티 CD28 항체 (FITC-복합 항 마우스 IgG2a를 사용하여) : aAPCs에 표면 단백질의 FACS의 착색 A) aAPCs은 CD1d의 존재에 대해 테스트되었습니다 . 오픈 histograms는 isotype 제어를 나타냅니다, 채워진 histograms에 표시된 항체를 나타냅니다. CD1d-IG 표현 aAPC는 NKT 세포가 IL-2 생산을 자극 할 수 있습니다. B) Vα14 + 마우스 NKT 세포 하이 브리 도마, DN32.D3은 어느 매체, 가용성 항원 (α-GalCer), aAPC 또는 α-GalCer -로드 aAPC 하역과 cocultured되었습니다. 문화 supernatants는 수확 된 표준 샌드위치 엘리사는 IL-2 생산을 측정하기 위해 사용되었다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> 그림 3. CD1d-IG 코팅 인공 항원 제시 세포에 의한 NKT 세포의 확장. (A) 기본 3 번 CD + CD161 + 더블 긍정적 인 세포가 자기 분리를 사용하여 PBMCs으로부터 격리되었다. 정렬 세포는 α-GalCer로드, 14 일 동안 CD1d-IG 코팅 aAPC을 자극했다. 세포는 Vα24와 Vβ11 다음 aAPC 자극에 얼룩이했다. (B) 기본 인간의 NKT 세포는 B 세포 림프종 라인의 용해를 중재. 항원의 유무, 20-24 시간에 96도 U-바닥 판에-GalCer (100 NG / ML)에 지정된 비율에서 NKT 세포와 incubated C1R - CD1d 세포. NKT 세포 매개 세포 용해가 표준 51Cr 릴리스 분석에 의해에 의해 평가되었다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> 4 그림. aAPC 확장 된 NKT 세포의 시토 킨 프로파일. </strong&gt; 두 주 동안 α GalCer로드 aAPC, 확장 된 NKT 세포 (1 × 10 5 / 잘)이 용해 α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 microbeads, 또는 α-GalCer로드 aAPC과 cocultured 했나요 자극 후 (2 × 10 5도 /) 48 시간 용. (A) IL-17A, (B) TNF-α, 그리고 (C) IFN-γ 생산 표준 시토 킨 엘리사에 의해 측정되었다. 데이터가 표시 부정적인 컨트롤 (미디어 및 빈 구슬) 차감 후 순 시토 킨 생산합니다. (D) 기본 T 세포는 PBMC는 자기 구슬 분리를 사용하여 분리되었습니다. 정렬 셀 - GalCer로드 - aAPC 표시와 함께 두 주 동안 자극했다. 세포가 Vα24에 대한 특정 애비를 사용하여 얼룩 져 있었다 +와 Vβ11 + 및 유동 세포 계측법에 의해 분석했다.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

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