Name: artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Priyanka Subrahmanyam for personer diskusjoner. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, CA162277, R21 og P30 Tumor Immunologi og Immunterapi Program til TJ Webb. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Cancer Institute eller National Institutes of Health.

1. Generasjon av AAPC <ol><li> Før du legger proteiner til perler, forberede alle reagenser og buffere: 0.1M boratbuffer, 1X D-PBS (ingen Ca 2 + og Mg 2 +), Bead Wash Buffer (1X PBS 5% Human AB serum + 0,02% natriumazid) ; Komplett medium (RPMI medium 100 mM natrium pyruvat, 10 mM ikke-essensielle vitamin løsning, 100 mM MEM Vitamin løsning, 1% 2-merkaptoetanol, 10 pM ciprofloksacin, 5% Menneskelig AB serum); MACS-buffer (1 L PBS gratis av Ca 2 + og Mg 2 +, 5 g BSA og 2 mmol EDTA). </li><li> Skylling 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy perler med 3 ml steril 0,1 M boratbuffer (borsyre og vann, pH 7,0 til 7,4) i en 5 ml klart borsilikatglass gjenget hetteglass. </li><li> I en separat 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 100 ug hCD1d-Ig dimer og 20 pg costimulatory molekyler (eksempel: anti-CD28mAb) til 1 ml PBS w / o Ca2 + eller Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Place perle inneholder hetteglass på magnet og aspirer boratbuffer fra perler. Legg proteinblandingen fra trinn 1.2 til hetteglass og erstatte cap. Bland umiddelbart ved å invertere hetteglasset, dekke hetten med parafilm, og plassere på en rotator og inkuber over natten ved 4 ° C. </li><li> Neste dag, sted hetteglass på magnet og fjerne protein blanding, mens nøye unngå perler. Vask kulene ved tilsetning av 3 ml perle vaskebuffer (PBS med 5% AB serum 0,02% natriumazid), og inkubering ved 4 ° C på en rotator i 5 min. Gjenta to ganger. </li><li> Perler kan lagres i denne perle vask blandingen. Å lage funksjonelt AAPC, fjerne en liten delmengde og telle perlene ved hjelp av en hemacytometer. Kontroller at proteinene blir stabilt innlastet perler ved farging med antistoffer (ex. PE-konjugert anti-mus IgG1) og utføre flowcytometrisk analyser. </li><li> Å laste perler med antigen, fjerne 5 x 10 7 perler, og legge til en liten 1,5 ml hetteglass, skyll perler med 1 ml steril PBS. Resuspend vasket perler med 1 ml steril PBS og legge antigen, eksempel: Load med α-GalCer/KRN7000 (5mg). * Merk: Mens, har vi ikke oppdaget noen problemer med lipid løselighet eller micelle formasjon, bør lipider behandles i henhold til produsentens anbefalinger. Spesifikt ble KRN7000 rekonstituert i DMSO (1mg/ml) for disse studiene. KRN7000 og andre glycolipid antigener kan også bli oppløst i 0,2 mg / ml PBS inneholdende 0,5% Tween-20 (sonicate 2 hr. Ved 37 ° C). VIKTIG-The AAPC må lastes for minst 48-72 timer før bruk. </li></ol> 2. Isolering av CD161 + CD3 + celler <ol><li> Samle perifert blod mononukleære celler (PBMC). For Ficoll tetthetsgradient sentrifugering separasjon av lymfocytter fra en buffy coat eller leukopheresis pack, første fortynnes heparinisert blod med et likt volum 1X PBS ved romtemperatur. </li><li> Tilsett 15 ml Ficoll (oppvarmet til romtemperatur) til 50 ml koniske rør. Sakte overlegg25 ml av den fortynnede blod blandingen på toppen av Ficoll. Sentrifuger ved 2000 rpm i 30 minutter ved romtemperatur med brems. </li><li> Fjern forsiktig lymfocytt grensesnittet (hvit ring mellom media og Ficoll) med en Pasteur pipette og overføres til en ny 50 ml konisk rør. </li><li> Vask cellene ved å fylle opp røret til 50 ml med PBS og sentrifugering ved 1500 rpm i 5 min. Kast supernatanten og kombinere rørene fra en enkelt person i et enkelt rør og vaske de perifere mononukleære blodceller (PBMC) igjen med 20 ml PBS. Deretter telle PBMC og resuspender i en konsentrasjon av 5 x 10 7 celler / ml i MACS-buffer (1 L PBS uten Ca2 + og Mg 2 +, 5 g BSA og 2 mmol EDTA). </li><li> For å isolere den T celle fraksjonen, begynn med 2 ml PBMC (10 8 celler) og tilsett 100 ul av Pan T celle berikelse løsning fra EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Inkuber ved romtemperatur i 10 min. </li&gt; <li> Legg 100 pl magnetiske partiklene til oppløsningen og inkuber ved romtemperatur i en annen 10 min. Bring sluttvolumet av oppløsningsmiddel til 2,5 ml og plassere røret i lilla magnet i 5 min. Raskt hell av CD3 + brøkdel til en 15 ml konisk tube. </li><li> Vask cellene ved tilsetning av 5 ml kaldt MACS buffer, telle antall levedyktige celler, og fjerne en alikvot for FACS farging. </li><li> Å velge CD161 + celler, første resuspender beriket T celler i 980 ul iskald MACS buffer, tilsett 10 mikrogram anti CD161 mAb og inkuber i kjøleskapet i 10 min. </li><li> Sentrifuger cellene ved 1500 rpm ved 4 ° C i 5 min. Deretter rekonstituere cellepelleten i 800 ul MACS-buffer. Tilsett 200 pl anti-mus IgG1 mikroperler og inkuber løsningen i 10 min ved 4 ° C. </li><li> I løpet av denne inkubasjonstrinn, stabilisere en LS kolonne ved å legge 3 ml MACS buffer. </li><li> Neste, vaske cellene ved sentrifugering 1500 rpm ved 4 ° C i 5 min. Resutilbringer cellene i 3 ml MACS-buffer. Deretter pipetteres cellene i LS MACS skille kolonne. Sørg for å unngå å generere bobler ved pipettering sakte. Skyll kolonnen ved tilsetning 3 ml MACS-buffer. Gjenta to ganger. </li><li> Tilsett 3 ml frisk MACS buffer og fjerne kolonnen fra magnet. Plass kolonne i en 15 ml konisk rør. Sett stempelet og presse ut innholdet for å oppnå renset CD161 + CD3 + celler. Antall NKT celle fraksjon. Du bør har 2-4 millioner celler. </li></ol> 3. AAPC-mediert NKT Cell Expansion <ol><li> Sett opp co-kultur ved å legge til 10 6 beriket CD161 + CD3 + T-celler og 10 6 AAPC i 16 ml komplett medium (komplett medium + IL-2, 100 U / ml). Plate denne blandingen ved tilsetning av 160 ul / brønn sluttvolum til en 96 brønn vev-kultur behandlet polystyren, U-bunnplate med lav fordampning lokk. Utfør middels utveksling hver 7. dag ved å legge 80 pl av fersk medium. </li><li> Innhøstingceller, telle, og utføre FACS flekker på dag 12-14. </li><li> De utvidede NKT celler kan replated som beskrevet ovenfor i trinn 3.1, spesielt resuspender 10 6 utvidede T-celler og 10 6 AAPC i 16 ml komplett medium. Plate denne blandingen ved tilsetning av 160 ul / brønn i 96 brønns U-bunnplaten. Fortsett å oppdatere coculture medium hver 7. dag ved å legge 80 pl av fersk medium. </li><li> Det er best å fryse ekstra NKT-celler etter den andre runden av ekspansjon (1 x10 6 / cryovial i 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) </li></ol> 4. Funksjonell Test: AAPC-mediert Stimulering av NKT celler <ol><li> Sett opp 5x10 4 NKT celler / brønn med 5x10 5 AAPC i 200 ul sluttvolum (komplett medium) i 96 godt U-bunnplaten. </li><li> Innhøsting cellekultur supernatant for ELISA 24-48 hr. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

AAPC kan brukes til å studere de grunnleggende krav til NKT celle aktivering og det har potensiale klinisk verdi for ex vivo ekspansjon av NK T celler for adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev en av de første bead baserte systemer, hvor biotinylert murint MHC klasse I-peptid-enkelt kjede konstruerer ble kombinert med biotinylerte costimulatory molekyler B7.1 og B7.2 via streptavidin til overflaten av lateks 14 mikrokuler, 15. Denne tilnærmingen har med hell blitt brukt til å stimulere antigen-spesifikke T-celler fra transgene mus. I tillegg, siden denne tilnærmingen benytter en enkelt kjede MHC-peptid kompleks å sikre homogen lastingen av MHC molekyler, ville hver målpeptidet antigen krever nytt transfeksjon for ekspresjon av det ønskede enkeltkjedet MHC-peptid kompleks, og dermed begrense allmenngyldigheten av det tilnærming. Viktigere, pioner Dr. Schneck gruppe perlen baserte-AAPC, ved å utvikle en annen ikke-cellulær perle basert AAPC, Laget ved kobling HLA-Ig, signal 1, og anti-CD28, signal 2, bort magnetiske perler. HLA-Ig, en unik multimeric form for HLA smeltet til et immunglobulin molekylær 16 stillaset, 17 ble utviklet av sin gruppe. Deretter, utviklet de MHC-Ig basert AAPC, som har vist seg å effektivt utvide CMV og MART-1 spesifikk CTL 18. Her har vi demonstrert at CD1d-Ig basert AAPC kan brukes til å utvide funksjonelle NKT-celler. En studie har brukt et lignende system for å undersøke den fysiske interaksjonen av NK-celler med CD1d 19. Spesielt har vi utviklet en kunstig antigen presentasjon celle som er tilpasningsdyktig til eventuelle krav vi finner nødvendig for optimal NKT celleproliferasjon. Den AAPC utvidelse metoden gir en enkel og pålitelig metode for å utvide og berike menneskelige NKT-celler. Vår AAPC kan endres til systematisk vurdere rollen et panel av potensielle costimulatory molekyler og vurdere sin rolle på NKT celle proliferasjon og funksjon. Dermed AAPC representerer en robust allsidig teknologien nyttig for å indusere og utvide NKT-celler. Generering av aAPCs tar mindre enn en uke og er egnet for produksjon av store mengder av perler. Imidlertid, er et kritisk trinn i å generere AAPC å bekrefte at CD1d-Ig er stabilt immobilisert på overflaten av kulene og for å vurdere deres funksjonalitet for å sikre konsistens fra parti til parti. En potensiell begrensning av systemet er at det ikke er en mekanisme på plass for å slå av stimulering, annet enn mekanisk fjerning av kulene. Spesifikt, engasjement av T-celle reseptor (TCR) med antigen: CD1d/MHC kompleks typisk generere immunologiske synapse i konsert med tilbehør / adhesjonsmolekyler, som kan resultere i induksjon av hemmende eller undertrykkende forhold både på T-celle og antigenpresenterende celle. I AAPC systemet kan disse faktorene blir oppregulert av T celle, men vulsten vil ikke uttrykke beslektede liganderfor disse reseptorene. I tillegg har CD4 + NKT-celler vist seg å undertrykke antitumor responser i mus og mennesker, derfor er det mulig at ikke-selektive aktivering av alle NKT celler (dvs. Global stimulering med α-GalCer) eller aktivering av feil delsett kan resultere i uønsket immunologiske utfall. Følgelig må en fenotypisk og funksjonelt karakterisere AAPC ekspanderte NKT cellepopulasjon. Som vist i figur 4, har vi funnet at stimulering med α-GalCer-loaded AAPC uttrykke anti-CD28 kan resultere NKT celler som produserer TM1, TM2, og Th17 attraksjon cytokiner. Murine studier har rapportert at utfordringen med IL-33, en nylig identifisert cytokin, resulterte i økte nivåer av sirkulerende inflammatoriske cytokiner som IL-5 og IL-13. Behandling av NKT-celler med IL-33 forbedret sin cytokin produksjon 20. IL-33 er en spesifikk ligand for ST2 og det har blitt vist at løselig ST2 can blokk IL-33 signalering. Således, som et eksempel på en fremtidig anvendelse, kunne AAPC uttrykke ST2 genereres og brukes for å bestemme om en kan selektivt hemme produksjonen av Th2-cytokiner mens inducing Th1 cytokin sekresjon av NKT-celler. Det har også blitt rapportert at iv injeksjon av Kb-uttrykke AAPC inn C57BL / 6 mus resulterte i redusert lunge metastasering av tumor 21. Viktigere, Disse data viser at AAPC trafikk til lungen og er i stand til å aktivere T-celle-effektor undergrupper. Derfor kan man generere flere typer AAPC og undersøke samspillet mellom antigen spesifikke T celle undergrupper. For å oppsummere, disse studiene viser at CD1d-Ig basert AAPC kan brukes til å erstatte normal mobilnettet APC, og må potensial til å forbedre nåværende kliniske tilnærminger for NKT celle basert-adoptiv immunterapi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human T Cell Enrichment Kit </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 human mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus IgG1 mikroperler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI Rekombinant Løselig Dimere Mouse CD1d: IG Fusion Protein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy perler </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke-essensielle aminosyrer </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamin Solution </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloksacin </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti mus IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-mus IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, ingen kalsium, ingen magnesium </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> American Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Human AB Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polystyren rundbunnet rør </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glass Sample Hetteglass med Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Liten (03-343-6A) Stor (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Naturlig killer T (NKT) celler er en unik undergruppe av T-celler som viser markører karakteristiske av både naturlige killer (NK) celler og T-celler 1. Motsetning klassiske T celler, NKT celler gjenkjenner lipid antigen i sammenheng med CD1 molekyler 2. NKT-celler uttrykker en invariant TCRα kjede omleiring: Vα14Jα18 i mus og Vα24Jα18 i mennesker, som er forbundet med Vβ kjeder av begrenset mangfold 3-6, og er referert til som kanoniske eller invariant NKT (i NKT) celler. I likhet med konvensjonelle T-celler, NKT-celler utvikles fra CD4-CD8-thymus forløperen T-celler etter den riktige signaler ved CD1d 7. Muligheten til å utnytte NKT celler for terapeutiske formål har betydelig økt med evnen til å stimulere og utvide humane NKT celler med α-Galactosylceramide (α-GalCer) og en rekke cytokiner 8. Viktigere, beholdt disse cellene deres opprinnelige phenotype, utskilte cytokiner og fremviste cytotoksisk funksjon mot tumorcellelinjer. Således, ex vivo utvidede NKT celler forblir funksjonelle og kan brukes for adoptiv immunterapi. Imidlertid har NKT celle basert-immunterapi vært begrenset ved bruk av autologe antigenpresenterende celler og mengden og kvaliteten av disse stimulator celler kan variere betydelig. Monocytt-avledet DC fra kreftpasienter har blitt rapportert å uttrykke reduserte nivåer av costimulatory molekyler og produserer mindre inflammatoriske cytokiner 9,10. Faktisk har murine DC fremfor autolog APC blitt brukt for å teste funksjonen av NKT celler fra CML pasienter 11. Imidlertid kan dette systemet bare brukes for in vitro testing siden NKT cellene ikke kan utvides ved muse DC og deretter brukt for adoptiv immunterapi. Dermed kunne et standardisert system som er avhengig av kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) produserer den stimulerende effekten av DC uten fallgrubene allo-eller xenogeneiske ce12 LLS, 13 år. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for å generere CD1d-baserte AAPC. Siden engasjement av T-celle reseptor (TCR) ved CD1d-antigen komplekser er et grunnleggende krav i NKT celleaktivering, antigen: CD1d-Ig komplekser gir en pålitelig metode for å isolere, aktivere og utvide effektor NKT celle populasjoner.

Heri beskriver vi en fremgangsmåte for å generere CD1d-Ig basert AAPC, laget av kovalent kobling av CD1d-Ig og anti-CD28 mAb til magnetiske kuler for å stimulere NKT celler som en standardisert metode for utbredelsen av NKT celler (figur 1). Først en må vise at de CD1d-Ig fusjonsproteiner blir stabilt immobilisert på overflaten av magnetiske kuler. Som vist i figur 2A, CD1d-Ig og anti-CD28-antistoffer ble begge uttrykt på overflaten av de magnetiske perler. Å undersøke stimulerende kapasitet AAPC, vi co-kulturperler NKT celle hybridomer med AAPC natten, høstes kultur supernatanter og målt IL-2 produksjonen av ELISA. Vi fant at CD1d-Ig basert AAPC kunne stimulere NKT celle hybridomer på nivåer lik eller høyere enn deres cellulære motstykker (Figur 3, data ikke vist). Interessant, fant vi at våre mus NKT celle hybridomer blir stimulert av menneskelig CD1d-baserte AAPC (FiGure 2B), som gir enkel metode for å teste hvert parti av AAPC. Neste, søkte vi å demonstrere forplantning potensialet AAPC, ble således humane T-celler isolert fra perifert blod. Først CD161 + CD3 + T celle fraksjon ble beriket av magnetisk perle separasjon. Deretter ble T-cellene stimuleres annenhver uke med α-GalCer-loaded AAPC. Viktigere, fant vi at selv med en relativt lav innledende NKT cellepopulasjon (0,03%), var vi i stand til å utvide cellene til ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (figur 3). Vi har utvidet NKT-celler fra PBMC av mange friske frivillige og kreftpasienter og har funnet at α-GalCer lastet AAPC kunne utvide NKT-celler befolkningen i begge gruppene. Spesielt var ekspansjonen rangere høyt donor avhengige. Som forventet høyere initial populasjonen av Vα24 + celler, jo større andelen av ekspansjon. I tillegg,ved bruk av en start befolkning på 2.000.000 celler CD161 + CD3 + T-celler, kan en skaffe&gt; 10 7 celler etter to runder med ekspansjon (Tabell 1). Omtrent 80-90% av de ekspanderte NKT cellene er CD4 +, ~ 5% CD8 +, og de ​​resterende er formodentlig CD4-CD8-dobbel negativ NKT-celler. Disse utvidede NKT celler kan brukes for funksjonelle studier som vist i figur 4A-C. Vi har funnet at vår ex vivo utvidet NKT celler forblir reagerer α-GalCer stimulering og er potente produsenter av IL-17A, TNF-α, og IFN-γ. Det bør bemerkes at dersom den første T-celle berikelse befolkningen er lav og en er i stand til å utføre den andre CD161 berikelse trinnet kan AAPC-mediert utvidelse ikke gir de forventede resultater (se Figur 4D, Donor 1). Men hvis prosentandelen av sirkulerende NKT celler er høyere enn 0,1%, bør en fortsatt være i stand til å oppnå en vesentlig utvidelseav I NKT-celler. Sammen er disse data demonstrerer at CD1d basert-AAPC kan brukes for effektivt å utvide og stimulere primære humane NKT-celler. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk diagram av CD1d: Ig-baserte aAPCs ekstracellulære deler av CD1d molekylet er smeltet til den konstante regionen av et immunglobulin tungkjede protein separert ved en kort aminosyre linker. Disse molekylene kan være lett lastet med lipid antigener, for eksempel α-GalCer, simpelthen ved å inkubere dem med et overskudd av lipid av interesse. AAPC ble gjort ved å koble CD1d-Ig og anti-CD Abs til magnetiske kuler. I dette systemet, er CD1d-Ig til å gi beslektede antigen-spesifikke signal gjennom TCR og anti-CD28 mAb gir costimulatory signalet. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. . FACS farging av overflateproteiner for aAPCs A) aAPCs ble testet for tilstedeværelse av CD1d: IgG dimer (via farging med PE-konjugert anti-mus IgG1) samt anti-CD28 antistoff (hjelp FITC-konjugert anti-mus IgG2a) . Åpne histogrammer angir isotype kontroll, fylt histogrammer representerer de angitte antistoffer. CD1d-Ig Uttrykke AAPC kan stimulere IL-2 Produksjon av NKT-celler. B) Vα14 + mus NKT cellehybridom, DN32.D3, ble cocultured med enten medium, løselig antigen (α-GalCer), lastet AAPC eller α-GalCer-lastet AAPC. Kultursupernatanter ble høstet og standard-sandwich ELISA ble anvendt for å måle IL-2-produksjon. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figur 3. Utvidelse av NKT-celler ved CD1d-Ig belagt kunstige antigenpresenterende celler. (A) Primær CD3 + CD161 + doble positive celler ble isolert fra PBMC ved hjelp av magnetisk separasjon. De sorterte celler ble stimulert med α-GalCer lastet, CD1d-Ig belagt AAPC i 14 dager. Cellene ble farget for Vα24 og Vβ11 følgende AAPC stimulering. (B) primære humane NKT cellemediert lysis av en B-celle lymfom linje. C1R-CD1d celler inkubert med NKT celler ved de angitte forhold i nærvær eller fravær av antigen, et-GalCer (100 ng / ml) i 96-brønners U-bunnplater for 20-24 hr. NKT cellemediert cellelyse ble vurdert av ved standard 51Cr-release-analysen. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figur 4. Cytokin profiler av AAPC-utvidede NKT-celler. </strong&gt; Etter stimulering med α GalCer lastet AAPC for to uker, de utvidede NKT-celler (1 × 10 5 / brønn) ble cocultured med løselig α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 mikroperler, eller α-GalCer lastet AAPC (2 x 10 5 / brønn) i 48 timer. (A) IL-17A, (B) TNF-α, og (C) IFN-γ produksjonen ble målt ved standard ELISA cytokin. Data som vises er netto cytokin produksjon fratrukket de negative kontroller (media og tomme perler). (D) Primære T-celler ble isolert fra PBMC ved hjelp av magnetisk bead separasjon. De sorterte celler ble stimulert i to uker med indikasjonen a-GalCer lastet-AAPC. Cellene ble farget med Abs spesifikke for Vα24 + og Vβ11 + og analysert ved strømningscytometri.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å aktivere og utvide humane NKT celler fra bulk T celle populasjoner ved hjelp av kunstig antigenpresenterende celler (AAPC). Bruken av CD1d-baserte AAPC gir en standardisert metode for å generere høye antallet funksjonelle NKT-celler.

Kunstig antigenpresenterende Cell (AAPC) mediert aktivering og utvidelse av Natural Killer T celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Og kunstig antigenpresenterende celler å genmodifisere T celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...