Name: artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka Priyanka Subrahmanyam för hjälp diskussioner. Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen. Detta arbete har finansierats med bidrag från American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, CA162277 R21 och P30 tumörimmunologi och immunterapi Program till TJ Webb. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Cancer Institute och National Institutes of Health.

1. Generering av AAPC <ol><li> Innan tillsats proteiner till pärlor, förbereda alla reagenser och buffertar: 0,1 M boratbuffert, 1X D-PBS (ingen Ca 2 + och Mg 2 +); Bead Tvättbuffert (1X PBS +5% humant AB-serum + 0,02% natriumazid) , fullständigt medium (RPMI-medium +100 mm natriumpyruvat, 10 mM icke-essentiella vitaminlösning, 100 mM MEM vitaminlösning, 1% 2-merkaptoetanol, 10 ^ iM ciprofloxacin, 5% humant AB-serum), MACS-buffert (1 L PBS fri av Ca 2 + och Mg 2 +, 5 g BSA och 2 mmol EDTA). </li><li> Skölj 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy pärlor med 3 ml steril 0,1 M boratbuffert (borsyra och vatten, pH 7,0-7,4) i en 5 ml klar borosilikatglas gängad flaska. </li><li> I en separat 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 100 pg hCD1d-Ig dimer och 20 pg molekyler samstimulerande (exempel: anti-CD28mAb) till 1 ml PBS w / o Ca 2 + eller Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Placera pärla med glasflaska på magnet och aspirera boratbuffert från pärlor. Lägg proteinblandning från steg 1,2 till glasflaska och ersätta locket. Blanda omedelbart genom att vända flaskan, täck locket med parafilm, och placera på en rotator och inkubera över natten vid 4 ° C. </li><li> Nästa dag, plats glasflaska på magneten och ta bort proteinblandningens samtidigt noggrant undviker pärlor. Tvätta kulorna genom tillsats av 3 ml pärla tvättbuffert (PBS med 5% AB-serum +0,02% natriumazid), och inkubering vid 4 ° C på en rotator under 5 min. Upprepa två gånger. </li><li> Pärlorna kan lagras i denna pärla tvättblandningen. För att göra funktionella AAPC, ta bort en liten alikvot och räkna kulorna med en hemacytometer. Kontrollera att proteinerna stabilt lastas på pärlorna genom färgning med antikroppar (ex. PE-konjugerad anti-mus lgG1) och utföra flödescytometriska analyser. </li><li> För att ladda pärlor med antigen, ta bort 5 x 10 7 pärlor, och lägga till en liten 1,5 ml glasflaska, skölj pärlor med 1 ml steril PBS. Resuspend tvättade pärlor med 1 ml steril PBS och tillsätt antigen, exempel: Ladda med α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Obs: När har vi inte upptäckt några problem med lipidlöslighet eller micellbildning bör lipider hanteras enligt tillverkarens rekommendationer. Specifikt KRN7000 rekonstituerades i DMSO (1mg/ml) för dessa studier. KRN7000 och andra glykolipid antigener kan också lösas i 0,2 mg / ml PBS innehållande 0,5% Tween-20 (sonikera 2 tim. Vid 37 ° C). VIKTIGT-Den AAPC måste laddas för minst 48-72 timmar före användning. </li></ol> 2. Isolering av CD161 + CD3 + celler <ol><li> Samla perifera mononukleära blodceller (PBMC). För Ficoll densitetsgradientcentrifugering separation av lymfocyter från en buffy coat eller leukoferes förpackning först späda hepariniserat blod med en lika stor volym av 1 x PBS vid rumstemperatur. </li><li> Tillsätt 15 ml Ficoll (värmdes till rumstemperatur) till 50 ml koniska rör. Långsamt överlägg25 ml av det utspädda blodet blandningen på toppen av Ficoll. Centrifugera vid 2.000 rpm under 30 minuter vid rumstemperatur med bromsen avstängd. </li><li> Försiktigt bort lymfocyt gränssnitt (vit ring mellan media och Ficoll) med en Pasteurpipett och överföra till ett nytt 50 ml koniskt rör. </li><li> Tvätta cellerna genom att fylla upp röret till 50 ml med PBS och centrifugering vid 1.500 rpm under 5 minuter. Kasta bort supernatanten och kombinera rören från en enda individ till ett enda rör och tvätta de perifera mononukleära blodceller (PBMC) igen med 20 ml PBS. Sedan räkna PBMC och återsuspendera vid en koncentration av 5 x 10 7 celler / ml i MACS-buffert (1 L PBS fritt från Ca 2 + och Mg 2 +, 5 g BSA och 2 mmol EDTA). </li><li> För att isolera den T-cellfraktionen, börja med 2 ml PBMC (10 8 celler) och tillsätt 100 | il Pan T-cell anrikning lösning från EasySep human T-cell Enrichment Kit. Inkubera vid rumstemperatur under 10 min. </li&gt; <li> Tillsätt 100 | il av magnetiska partiklar till lösningen och inkubera vid rumstemperatur i ytterligare 10 minuter. Bringa den slutliga volymen av lösningsmedel till 2,5 ml och placera röret i lila magneten under 5 min. Snabbt häll bort CD3 +-fraktionen i en 15 ml koniskt rör. </li><li> Tvätta cellerna genom tillsats av 5 ml kall buffert MACS, räkna antalet viabla celler, och avlägsna en alikvot för FACS-färgning. </li><li> För att välja de CD161 + celler, första återsuspendera berikade T-celler i 980 pl iskall MACS buffert, tillsätt 10 g anti CD161 mAb, och inkubera i kylskåp i 10 minuter. </li><li> Centrifugera cellerna vid 1.500 rpm vid 4 ° C under 5 min. Sedan rekonstituera cellpelleten i 800 | il av MACS buffert. Tillsätt 200 | il av anti-mus IgG1 mikropärlor och inkubera lösningen under 10 min vid 4 ° C. </li><li> Under detta inkubationssteg, jämvikta en LS-kolonn genom att tillsätta 3 ml MACS buffert. </li><li> Därefter tvättas cellerna genom centrifugering 1.500 rpm vid 4 ° C under 5 min. Resutillbringar cellerna i 3 ml MACS buffert. Sedan pipettera cellerna i LS MACS separationskolonnen. Se till att undvika att skapa bubblor genom att pipettera långsamt. Skölj kolonnen genom tillsats av 3 ml av MACS buffert. Upprepa två gånger. </li><li> Tillsätt 3 ml färsk MACS buffert och ta bort kolumnen från magneten. Placera kolonn i en 15 ml koniskt rör. Sätt kolven och tryck ut innehållet för att få renade CD161 + CD3 + celler. Greve NKT cell anrikad fraktion. Du bör har 2-4 miljoner celler. </li></ol> 3. AAPC-medierad NKT cell Expansion <ol><li> Ställ in samodling genom tillsats 10 6 anrikade CD161 + CD3 + T-celler och 10 6 AAPC i 16 ml komplett medium (komplett medium + IL-2, 100 U / ml). Platta denna blandning genom tillsats av 160 | il / brunn slutlig volym till en 96 väl vävnads-kultur behandlad polystyren, U-bottenplatta med låg avdunstning lock. Utför mediumutbyte var 7: e dag genom att tillsätta 80 pl färskt medium. </li><li> Skördceller, räkna och utföra FACS färgning dag 12-14. </li><li> De expanderade NKT celler kan replated såsom beskrivits ovan i steg 3,1, särskilt resuspendera 10 6 expanderade T-celler och 10 6 AAPC i 16 ml komplett medium. Platta denna blandning genom tillsats av 160 | il / brunn till en 96 brunnars U-bottenplatta. Fortsätta att uppdatera samodling mediet var 7: e dag genom att tillsätta 80 pl färskt medium. </li><li> Det är bäst att frysa extra NKT celler efter den andra omgången av expansionen (1 x 10 6 / köldkärlet i 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) </li></ol> 4. Funktionell Test: AAPC-medierad stimulering av NKT-celler <ol><li> Ställ in 5x10 4 NKT celler / brunn med 5x10 5 AAPC i 200 pl slutlig volym (komplett medium) i 96 brunnars U-bottenplatta. </li><li> Skörd cellkultursupernatant för ELISA efter 24-48 timmar. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

AAPC kan användas för att studera de grundläggande kraven för NKT cellaktivering och det har potential kliniskt värde för ex vivo expansion av NKT-celler för adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev en av de första vulsten system, där biotinylerad murin MHC klass I-peptid-enkelkedjiga konstruktioner kombinerades med biotinylerade samstimulerande molekyler B7.1 och B7.2 via streptavidin till ytan av latex-mikrosfärer 14, 15. Detta tillvägagångssätt har med framgång använts för att stimulera antigenspecifika T-celler från transgena möss. Dessutom, eftersom detta tillvägagångssätt använder en enda kedja MHC-peptidkomplex för att säkerställa homogen laddning av MHC-molekyler, skulle varje mål peptidantigen kräva en ny transfektion för uttryck av den önskade enkelkedjiga MHC-peptidkomplex, vilket begränsar allmängiltigheten av tillvägagångssätt. Det är viktigt att pionjärer Dr Schneck grupp pärlan baserade-AAPC, genom att utveckla en icke-cellulära pärla baserad AAPC, Genom koppling HLA-Ig, signalen 1, och anti-CD28, signalen 2, på magnetiska pärlor. HLA-Ig, en unik multimer form av HLA smält till en immunglobulin molekylär byggnadsställning 16, 17 har utvecklats av hans grupp. Därefter utvecklade de MHC-Ig baserade AAPC, som har visat sig effektivt expandera CMV och MART-1-specifika CTL 18. Här har vi visat att CD1d-Ig baserade AAPC kan användas för att expandera funktionella NKT celler. En studie har använt ett liknande system för att undersöka den fysiska interaktionen av NK-celler med CD1d 19. Särskilt har vi utformat en konstgjord antigenpresenterande cell som kan anpassas till de krav som vi finner nödvändiga för optimal NKT cellproliferation. Den AAPC expansion metod ger en enkel och tillförlitlig metod för att utvidga och berika människor NKT celler. Vår AAPC kan modifieras för att systematiskt utvärdera rollen av en panel av potentiella samstimulerande molekyler och bedöma deras roll på NKT cell proliferaning och funktion. Således AAPC utgöra en solid mångsidig teknik användbar för att framkalla och utvidga NKT celler. Genereringen av aAPCs tar mindre än en vecka och är lämplig för produktion av stora mängder av pärlor. Emellertid är ett kritiskt steg i att skapa en AAPC att bekräfta att CD1d-Ig stabilt immobiliseras på ytan av pärlorna och bedöma deras funktionalitet att säkerställa enhetlighet från sats till sats. En potentiell begränsning av systemet är att det inte är en mekanism för att stänga av stimuleringen, annan än mekaniskt avlägsnande av pärlorna. Specifikt ingreppet av T-cellreceptorn (TCR) med antigen: CD1d/MHC komplexet generera typiskt immunologiska synapsen tillsammans med accessoriska / adhesionsmolekyler, som kan resultera i induktion av inhiberande eller undertryckande faktorer på både T-cellen och antigenpresenterande cell. I det AAPC systemet, kan dessa faktorer vara uppreglerad av T-cellen, men kulan kommer inte uttrycka de besläktade ligandernaför dessa receptorer. Dessutom har CD4 + NKT-celler visat sig undertrycka antitumör responser i möss och människor, det är därför möjligt att icke-selektiv aktivering av alla NKT celler (dvs. globala stimulering med α-GalCer) eller aktivering av fel delmängden kan resultera i oönskad immunologisk resultat. Följaktligen måste en fenotypiskt och funktionellt karakterisera AAPC expanderade NKT cellpopulationen. Såsom visas i fig 4, har vi funnit att stimulering med α-GalCer-laddad AAPC uttryckande anti-CD28 kan resultera NKT celler producerar Th1, Th2 och Th17 cytokiner typ. Murina studier har rapporterat att utmaningen med IL-33, en nyligen identifierad cytokin, resulterade i ökade nivåer av cirkulerande inflammatoriska cytokiner såsom IL-5 och IL-13. Behandling av NKT-celler med IL-33 ökat sin cytokinproduktion 20. IL-33 är en specifik ligand för ST2 och det har visat sig att lösliga ST2 CAn blockera IL-33-signalering. Sålunda, som ett exempel på en framtida tillämpning, skulle AAPC uttryckande ST2 genereras och användas för att bestämma om man kunde selektivt inhibera produktionen av Th2-cytokiner samtidigt inducera Th1 cytokinutsöndring av NKT celler. Det har också rapporterats att intravenös injektion av Kb-uttryckande AAPC till C57BL / 6 möss resulterade i minskad lungmetastas av tumör 21. Viktigt, visar dessa data att AAPC trafik till lungan och kan aktivera effektor-T-cell-underuppsättningar. Därför kunde en generera flera typer av AAPC och undersöka samspelet mellan antigenspecifika undergrupper T-cell. Sammanfattningsvis dessa studier visar att CD1d-lg baserad AAPC kan användas för att ersätta normala cellulära APC och måste potential att öka de nuvarande kliniska metoder för NKT cellbaserad-adoptiv immunterapi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep human T-cell Enrichment Kit </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19.051 </td><td></td></tr><tr><td> Allofykocyanin CD161 humant mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550.968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18.002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus lgG1 mikropärlor </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI rekombinant lösligt Dimeric Mus CD1d: IG fusionsprotein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28-mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302.914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy pärlor </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alfa-galaktosylceramid (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640-medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitaminlösning </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342.904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (klon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (klon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123.510 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-mus-lgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556.650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-anti-mus-IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407.105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, inget kalcium, magnesium ingen </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Amerikanska Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431.788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.043 </td><td></td></tr><tr><td> Humant AB-serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polystyren rundbottnade rör </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glass provflaskor med Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Små (03-343-6A) Stor (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Naturliga mördar-T (NKT) celler är en unik undergrupp av T-celler som visar markörer karaktäristiska för både naturliga mördar (NK)-celler och T-celler 1. Till skillnad klassiska T-celler, NKT-celler känner igen lipid antigen i samband med CD 1-molekyler 2. NKT-celler uttrycker en invariant TCRα kedja omlagring: Vα14Jα18 hos möss och Vα24Jα18 hos människor, som är förknippade med Vp kedjor av begränsad mångfald 3-6 och kallas kanoniska eller invariant NKT (i NKT-celler). Liknar konventionella T-celler, NKT celler utvecklas från CD4-CD8-tymusceller föregångare T följa lämplig signalering från CD1d 7. Möjligheten att utnyttja NKT celler för terapeutiska ändamål har ökat betydligt med förmågan att stimulera och utveckla mänskliga NKT celler med α-galaktosylceramid (α-GalCer) och en mängd olika cytokiner 8. Viktigt, behöll dessa celler sin ursprungliga phenotype, utsöndrade cytokiner och visade cytotoxisk funktion mot tumörcellinjer. Sålunda, ex vivo expanderade NKT celler förblir funktionell och kan användas för adoptiv immunterapi. Emellertid har NKT cellbaserad-immunoterapi varit begränsad genom användning av autologa antigenpresenterande celler och kvantiteten och kvaliteten av dessa stimulatorceller kan variera avsevärt. Monocyt-härledd DC från cancerpatienter har rapporterats uttrycka reducerade nivåer av samstimulerande molekyler och producera mindre inflammatoriska cytokiner 9,10. I själva verket, har murina DC snarare än autologa APC använts för att testa funktionen av NKT celler från CML-patienter 11. Emellertid kan detta system endast användas för in vitro-testning sedan NKT celler inte kan expanderas genom murin DC och sedan användas för adoptiv immunterapi. Således kan ett standardiserat system som bygger på konstgjorda antigenpresenterande celler (AAPC) producera stimulerande effekterna av DC utan de fallgropar av allo-eller xenogen ceLLS 12, 13. Häri beskriver vi en metod för att generera CD1d-baserad AAPC. Eftersom inkoppling av T-cell receptorn (TCR) genom CD1d-antigenkomplex är ett grundläggande krav för NKT cells aktivering, antigen: CD1d-Ig-komplex ger en tillförlitlig metod för att isolera, aktivera och expandera effektor NKT cellpopulationer.

Häri beskriver vi en metod för att generera CD1d-Ig baserade AAPC, genom kovalent koppling av CD1d-Ig och anti-CD28-mAb till magnetiska pärlor att stimulera NKT-celler som en standardiserad metod för förökning av NKT-celler (figur 1). Första, måste man visa att CD1d-Ig fusionsproteiner stabilt immobiliseras på ytan av de magnetiska pärlorna. Såsom visas i figur 2A, CD1d-Ig och anti-CD28-antikroppar båda uttryckta på ytan av de magnetiska pärlorna. För att undersöka stimulerande kapacitet AAPC samarbetar vi odlade NKT cellhybridom med AAPC natten skördas, det odlingssupernatanter och uppmätt IL-2 produktionen med ELISA. Vi fann att CD1d-Ig baserade AAPC kunde stimulera NKT cellhybridom på nivåer som är lika med eller högre än deras cellulära motsvarigheter (fig 3, data ej visade). Intressant nog fann vi att våra mus NKT cellhybridom stimuleras av humant CD1d-baserade AAPC (FiGure 2B), vilket ger enkel metod för att testa varje sats av AAPC. Därefter försökte vi visa förökning potential AAPC, var således humana T-celler isolerade från perifert blod. Först CD161 + CD3 + T-celler fraktionen berikas av magnetiska pärlor separation. Därefter T-cellerna stimuleras varannan vecka med α-GalCer-laddad AAPC. Viktigt fann vi att även med en relativt låg initial NKT cellpopulation (0,03%), kunde vi utöka cellerna till ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (Figur 3). Vi har expanderat NKT celler från PBMC många friska försökspersoner och patienter cancer och har funnit att α-GalCer laddad AAPC kunde utöka NKT-celler befolkningen i båda grupperna. Anmärkningsvärt var expansionstakten kraftigt donator beroende. Som väntat högre den initiala populationen av Vα24 + celler, desto större andel av expansion. Dessutom,vid användning av en utgångspopulation av 2 miljoner celler CD161 + CD3 + T-celler, kan man erhålla&gt; 10 7 celler efter två omgångar av expansion (tabell 1). Ungefär 80-90% av de expanderade NKT cellerna är CD4 +, ~ 5% CD8 +, och de återstående är förmodligen CD4-CD8-dubbla negativa NKT celler. Dessa utökade NKT celler kan användas för funktionella studier som visas i figur 4A-C. Vi har funnit att vår ex vivo expanderade NKT celler kunna anpassas till α-GalCer stimulering och är potenta producenter av IL-17A, TNF-α och IFN-γ. Det bör noteras att om den ursprungliga T-cell anrikning befolkningen är låg och en är oförmögen att utföra det andra CD161 anrikningssteg kan AAPC-medierad expansionen inte ger de förväntade resultaten (se figur 4D, Donator 1). Men om andelen cirkulerande NKT celler är högre än 0,1%, bör man fortfarande kunna erhålla en avsevärd expansionav I NKT celler. Sammantaget visar dessa data att CD1d baserad-AAPC kan användas för att effektivt expandera och stimulera primära humana NKT-celler. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figur 1. Skiss av CD1d: Ig-baserade aAPCs Extracellulära delar av den CD1d molekylen fusionerad till den konstanta regionen av en immunglobulin tung kedja-protein åtskilda av en kort aminosyralinker. Dessa molekyler kan enkelt laddas med lipid antigener, såsom α-GalCer, helt enkelt genom att inkubera dem med ett överskott av lipid av intresse. AAPC framställdes genom koppling av CD1d-Ig och anti-CD-Abs till magnetiska pärlor. I detta system, är CD1d-Ig används för att tillhandahålla den besläktade antigenspecifik signal genom TCR och anti-CD28-mAb ger den samstimulerande signalen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. . FACS färgning av ytproteiner på aAPCs A) aAPCs testades med avseende på närvaron av CD1d: IgG-dimeren (genom färgning med PE-konjugerad anti-mus lgG1) samt anti-CD28-antikropp (med användning av FITC-konjugerad anti-mus-IgG2a) . Öppna histogram visar isotyp kontroll, fyllda histogram representerar de angivna antikropparna. CD1d-lg uttrycker AAPC kan stimulera IL-2-produktion av NKT-celler. B) Vα14 + mus NKT cellshybridom, DN32.D3 var samodlades med antingen medium lösligt antigen (α-GalCer) lossas AAPC eller α-GalCer-laddad AAPC. Odlingssupernatanter skördades och standard sandwich-ELISA användes för att mäta IL-2-produktion. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figur 3. Expansion av NKT-celler genom CD1d-Ig belagda artificiella antigenpresenterande celler. (A) Primär CD3 + CD161 + dubbla positiva celler isolerades från PBMC med magnetisk separation. De sorterade cellerna stimulerades med α-GalCer laddad, CD1d-Ig belagda AAPC under 14 dagar. Cellerna färgades för Vα24 och Vβ11 efter AAPC stimulering. (B) primära humana NKT cell lys av en B-cellslymfom linje. C1R-CD1d celler inkuberade med NKT-celler vid de angivna förhållandena i närvaro eller frånvaro av antigen, en-GalCer (100 ng / ml) i 96-brunnars U-bottnade plattor i 20-24 timmar. NKT cell-medierad cellys bedömdes genom genom vanlig 51Cr-frisättningsanalys. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figur 4. Cytokinprofiler av AAPC-expanderade NKT celler. </strong&gt; Efter stimulering med α GalCer laddad AAPC i två veckor, de expanderade NKT celler (1 x 10 5 / brunn) samodlades med lösligt α-GalCer, PMA / jonomycin, anti-CD3/28 mikropärlor eller α-GalCer laddad AAPC (2 x 10 5 / brunn) under 48 timmar. (A) IL-17A, (B) TNF-α, och (C) IFN-γ produktion mättes genom standard-ELISA cytokin. Data som visas är netto cytokinproduktion efter avdrag de negativa kontrollerna (media och tomma pärlor). (D) Primära T-celler isolerades från PBMC med användning av magnetiska pärlor separering. De sorterade cellerna stimulerades under två veckor med indikationen a-GalCer laddad-AAPC. Cellerna färgades med Abs specifika för Vα24 + och Vβ11 + och analyserades genom flödescytometri.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Här beskriver vi en metod för att aktivera och expandera humana NKT celler från bulk T-cell populationer med artificiella antigenpresenterande celler (AAPC). Användningen av CD1d-baserad AAPC ger en standardiserad metod för att generera ett stort antal av funktionella NKT celler.

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utveckling av ett antigen-driven kolit modell för att studera Presentation av antigener genom antigenpresenterande celler till T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...