Name: rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) og NIH tilskud AR052785 og AR046786 (AEO og W.-MW).

1. Forbered 0 til 2 dage gamle nyfødte mus for Hud Dissection <ol><li> Aflive mus unger under anvendelse af en CO2-kammer i mindst 20 min. Lad unger på is op til en time, indtil dissektion. P0-P2 mus er stærkt anbefales som celler fremstillet ud fra ældre mus har reduceret stamcelle kapacitet, der resulterer i lavere graft udbytter. Forbered en skål af 70% ethanol (for trin 1,3) og tre retter vaskeopløsning (til trin 3) når du er klar til at udføre hud dissektion. Optø Dispase Solution og lade det blive ved 4 ° C. Cervikal forskubbe unger efter CO 2 overeksponering for at sikre dødshjælp. </li><li> Placer aflives hvalpe i en kultur fad på is og overførsel til en steril flow hætte. </li><li> Vask hvalpe ved kort nedsænkning i 70% ethanol og anbringes på sterile dyrkningsskål. </li></ol> 2. Dissekere musehud <ol><li> Afbrød hvert ben og hale i bunden af ​​torsoen med steril saks. </li><li> Gribe kroppen fast mellem et par curved pincet og gøre et snit langs ryggens hud fra hoved til hale ved hjælp af en skalpel uden at trænge den underliggende fascia. </li><li> Forsigtigt huden bort fra midterlinien af ​​musen. </li><li> Tag fat i udsatte musen fast med den lange side af de buede pincet og indsætte et andet par krumme pincet under huden på den bageste ende af musen og træk forsigtigt hud over hofterne mod den ventrale halvdel af musen. </li><li> Træk forsigtigt huden helt væk fra musen i én glidende bevægelse og kassere slagtekroppen. </li></ol> 3. Vask huden og Inkuber med Dispase Solution <ol><li> Placer huden i den første skål vaskeopløsning med dermis nedad. Spred hud ud og agitere med pincet. Lad huden i den første skål af vaskeopløsning mens dissekere den næste hud. </li><li> Efter markedsføringen af ​​den næste dissekeret hud i den første skål af vaskeopløsning, overføre forudgående hud til den anden skål af vaskeopløsning. Hold skins i the sekunder vaskeopløsning indtil alle skind indsamles. Overfør alle skind til den sidste vask agitere kortvarigt. </li><li> Tilsæt 10 ml iskold Dispase til en steril 10 cm dyrkningsskål. Overfør huden til Dispase Solution og tromle huden dermis nedad. </li><li> Float hud i 8-16 timer ved 4 ° C (alternativ: 1 time ved 37 ° C). </li></ol> 4. Separat dermis og epidermis <ol><li> Overførsel huden til en ny steril kulturskål og tromle huden dermis nedad. Forsigtigt holde dermis fra det ene hjørne med en skalpel. </li><li> Tage fat i epidermis med en pincet og langsomt trække væk fra dermis. Epidermis bør skrælle væk som et stykke. Epidermis vil være hvid og tynd og dermis skal være brunlig, tykkere, og gelatinøse. </li><li> Adskille de to væv i separate sterile dyrkningsskåle. <ol class="lalpha"><li> At foretage en dermal specifikt gen knockdown / overekspression graft, at dermis og mos i meget små stykker med two skalpeller. Kassér epidermis. På dagen for infektion (trin 7), dissekere et andet sæt mus skind til fremstilling af friske, ubehandlede epidermisceller at kombinere med lentiviral-inficerede dermale celler. </li><li> For at gøre en epidermal specifik gen knockdown / overekspression graft, slice hver epidermis i 6 til 8 mindre stykker. Kassér dermis. På dagen for infektion (trin 7), dissekere et andet sæt mus skind til fremstilling af friske, ubehandlede dermale celler til at kombinere med lentiviral-inficerede epidermale celler. </li></ol></li></ol> 5. Dissocierer Primære Mouse dermale celler (mDCs) af findelt Tissue <ol><li> Dissocierer mDCs ved inkubering dermale stykker med frisklavet collagenaseopløsning ved 37 ° C i 1 time. Brug 10 ml collagenaseopløsning per mus hvalp. </li><li> Bland forsigtigt opløsning indeholdende dermis hver 10 min. Kontrollere omfanget af dissociation under et mikroskop, det fordøjede cellesuspension bør være hovedsagelig enkeltceller. Opløsningen ændres fra klar til uklar somdermale celler dissocieres fra dermis. </li><li> Læg FBS til collagenaseopløsning indeholdende dermis til en 10% slutvolumen at reducere aktiviteten af ​​collagenase. </li><li> Passere cellesuspensionen gennem en 70 pm cell strainer til et nyt 50 ml rør til at fjerne store ufordøjet klumper og hele follikler. Der tilsættes 10 ml DMEM/10% FBS pr 30 ml gennemløbet for yderligere at fortynde collagenase. </li><li> Centrifugerør indeholdende fordøjet dermis ved 30 x g på en bordcentrifuge i 5 minutter for yderligere at fjerne hele follikler. </li><li> Omhyggeligt Overfør supernatanten til et nyt 50 ml glas. Pellet-celler ved centrifugering ved 200 x g på en bordcentrifuge i 5 minutter. </li><li> Resuspender celler med DMEM/10% FBS (1 ml per pup) og tælle celler. Plade celler med Amniomax C-100 medier til infektion (trin 7), eller kombinere med lentivirus-inficerede KC til podning (trin 9). Typisk udbytte er 20 x 10 6 celler pr hvalp. </li></ol> 6. Dissociér Primær keratinocyts (KC) af findelt Tissue <ol><li> Dissocierer KC ved inkubering epidermale stykker med frisk optøet 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 15 minutter. Brug 7 ml trypsin-EDTA per mouse pup. </li><li> Bland forsigtigt opløsningen indeholdende epidermis hver 5 min. </li><li> Tilføj tilsvarende volumen neutraliserende opløsning til trypsin-EDTA indeholdende epidermis for at reducere aktiviteten af ​​trypsin. </li><li> Pellet-celler ved centrifugering ved 200 x g på en bordcentrifuge i 5 minutter. Resterende ufordøjet væv bør flyde ovenpå. </li><li> Hæld forsigtigt det meste af supernatanten med ufordøjet væv. Fjerner resterende supernatant med en 10 ml pipette uden at forstyrre cellepellet. Resuspendér cellepellet med PBS. I tilfælde KCS ikke pelleteret fuldstændigt, hæld det meste af supernatanten og gentag centrifugeringen indtil de fleste af cellerne pelleteres. </li><li> Strain cellesuspensionen gennem 70 pm cell strainer til et nyt rør for at fjerne tilbageværende væv eller klumper. </li><li> Pellet-celler ved centrifugeringved 200 x g på en bordcentrifuge i 5 minutter. </li><li> Resuspender cellerne i CnT-07 medier eller PBS (1 ml pr pup) og tælle celler. Brug CnT-07 for udpladning af celler til infektion (trin 7), tilsluttet PBS at kombinere med lentivirus-inficerede mDCs til podning (trin 9). Typisk udbytte er 3-10 x 10 6 celler pr hvalp. </li></ol> 7. Infect primære celler med lentivirus indeholdende shRNA eller cDNA På dagen for infektion dissekere et andet sæt mus skind til fremstilling af friske, ubehandlede primære KCS eller mDCs kan kombineres med virusinficerede celler på dagen for transplantation (trin 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> For mDCs, pladen 4 x 10 6 mDCs per 10-cm plade med AmnioMAX-C100 medie og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 for næste dag infektion med 50% celledensitet. Normalt 3-4 plader af mDCs anvendes til at frembringe en graft, og i alt 10 til 12 plader er nødvendige for at frembringe tre transplantater i et forsøg. Alternativt, lad mDCs vedhæfte og sprede feller mindst 2 timer ved 37 ° C + 5% CO2 og udfører infektion samme dag af celle udpladning. mDCs har fibroblast-lignende morfologi. </li><li> For KC, plade 12 x 10 6 KC pr 10-cm plade med CNT-07 medier og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO 2 til næste dag infektion. Alternativt lad KC vedhæfte og spredes i mindst 2 timer ved 37 ° C + 5% CO2 og udfører infektion på samme dag. Normalt 3-4 plader af KC anvendes til at frembringe en graft. I alt 10 til 12 plader er nødvendige for at frembringe tre transplantater til et eksperiment. KCS har brosten morfologi. </li></ol></li><li> Preincubate celler for 5-10 min med 8 pg / ml Polybrene opløsning ved 37 ° C + 5% CO2. </li><li> Udvekslingsmediet og tilføje lentivirus + 8 pg / ml Polybrene opløsning. Lentiviral titer vil variere afhængigt af konstruktionen anvendes og bør bestemmes før infektion. </li><li> Centrifugeres pladerne ved 200 x g på en bordcentrifuge i 1 time ved 32 °; C til at inficere celler med lentivirus. </li><li> Fjern lentivirus-holdige medier og tilsæt friske medier. For KC vaskes cellerne en gang med PBS, før du tilføjer tilbage friske medier. Normalt inficerede celler dækket natten over ved 37 ° C + 5% CO2. Alternativt skal der være mindst to timer passeret ved 37 ° C + 5% CO 2, inden trypsinizing cellerne for podninger. Fortsæt til kulturen en lille del af inficerede celler for at kontrollere for infektionseffektivitet som beskrevet i repræsentant afsnittet Resultater. </li></ol> 8. Forbered inficerede celler til podning <ol><li> Isoler friske primære mDCs eller KCS fra huden ved hjælp af trin 4-6. Resuspender celler i iskoldt steril PBS. Tælle celler. </li><li><ol class="lalpha"><li> For dermal specifikt gen knockdown / overekspression graft, dissocierer inficerede mDCs fra plader under anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 8 min. </li><li> For epidermal specifikt gen knockdown / overekspression graft, dissocierer inficerede KC fra pladerne USIng 0,125% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 15 minutter. </li></ol></li><li> Neutralisere trypsin aktivitet under anvendelse af DMEM + 10% FBS (mDCs) eller neutraliserende opløsning (KC). Overfør trypsinerede celler til et 50 ml rør. </li><li> Pellet-celler ved centrifugering ved 200 x g på en bordcentrifuge i 5 minutter. </li><li> Resuspender celler i iskoldt steril PBS. Tælle celler. </li><li> Kombiner de virusinficerede celler med den netop fremstillede ubehandlet modstykke celletype. For en graft, kombinere 7-10 x 10 6 mDCs med 7-10 x 10 6 KCS i iskoldt sterilt PBS og pellet cellen opslæmningen i en bordcentrifuge ved 4 ° C. Resuspender cellerne i 50 -100 pi iskold steril PBS. Hold celler på is, indtil nu / nu mus kamre er klar. </li></ol> 9. Opret Wound Bed and Fix Chamber på Back of nu / nu Mouse En dag før podning, sterilisere kirurgiske værktøjer med autoklav og sterilt silicium kamre ved iblødsætning i 70% ethanol. Udskift 70% EthAnol med steril PBS, før du bruger kamrene. <ol><li> Bedøve nu / nu mus (7-12 uger gamle hunner) ved anvendelse af ketamin (8 mg / ml) / xylazin (1,6 mg / ml) via intraperitoneal injektion (100 μl/10 g kropsvægt) eller anden foretrukne fremgangsmåde. Anvend øjet smøremiddel. Place varmepude under musen. </li><li> Desinficer nøgen mus tilbage huden med jod og rengør med spritservietter. </li><li> Tilsættes 1-3 dråber 0,25% bupivicain til incisionssted topisk. Klem den nøgne mus tilbage hud på bunden af ​​halsen med en pincet. </li><li> Skær et lille cirkulært hul (~ 1 cm i diameter) i sammenklemte hud med steril saks. </li><li> Anbring steril kammer over på sårleje og dække kammer kanter med omgivende hud. </li><li> Sikkert kammer på plads med sutur langs kammeret kanter (6 masker pr kammer) som vist i figur 2A. </li><li> Når kamre er klar, blidt hvirvel celleopslæmning og trække op i 23 gauge nål fastgjort til 1 ml sprøjte. Hvis celleopslæmning er kondenseret i bunden, forsigtigtopblande med 1 ml pipettespids før der drages ind i nålen. </li><li> Punktering kammer med nål og langsomt drypper celler på sår. </li><li> Placer mus i rene, autoklaverede bure. House 2 mus per bur og tilføje antibiotika og Tylenol (3 mg / ml) til drikkevand. Det er vores erfaring, har to kvindelige mus pr bur ikke resulteret i negative traumer til kammeret, graft, eller dyr. </li><li> Anbring opvarmning pad under halvdelen af ​​buret og observere musene indtil bedøvelsen aftager. </li></ol> 10. Fjern Chamber Efter 7-9 dage <ol><li> Anesthetize chambered nu / nu mus som i trin 9,1. Anvend øjet smøremiddel. </li><li> Desinficér huden omkring kammer med jod og rengør med spritservietter. </li><li> Skær forsigtigt masker og fjern fra kammeret. </li><li> Forsigtigt fjerne kammeret fra mus. Hvis nye hudtransplantat klæber til kammeret, løfte en del af kammeret og forsigtigt adskilt transplantat fra kammer ved hjælp af pincet. Hold graft nede under fjernelse af kammeret. Podning skal look kedelige og uigennemsigtig som i figur 2B. </li><li> Påfør en ikke-klæbende pude med en tynd film af antibiotika på det åbne sår og sutur på plads (2 sting). </li><li> Wrap forbinding om musen til at fastgøre puden og beskytte såret. Suturere forbinding på plads. </li><li> Silicium kamre renses ved skrubning med mild sæbe og skylles grundigt med deioniseret vand. Soak kamrene i 70% ethanol natten over, lufttørre, og butik. </li></ol> 11. Undersøg Mouse for hårvækst <ol><li> Fjern bandager og pad efter 3 dages kammer fjernelse. Graft skal være tør og uigennemsigtig til brun farve. </li><li> Tjek mus med jævne mellemrum for hårvækst. Hår bør begynde at vise på 16 dage efter graft. </li></ol> Procedure Outline Dag 1 (2-3 hr): Sacrifice nyfødte unger, fjerne hud, og efterlader på dispase ved 4 ° C natten over. Dag 2 (2-3 hr): Isoler primære celler fra hud ogplade ved anbefalede celletæthed. Dag 3 (3-4 hr): inficere celler med lentivirus. Fjern skind fra et andet sæt af nyfødte unger og lad den dispase ved 4 ° C natten over. Dag 4 (6-8 timer): Isoler primære celler fra hud, tælle, og lad på is. Recover lentivirus-inficerede celler ved trypsinisering og centrifugering, tælles, og kombinere 7-10 x 10 6 dermale celler og keratinocytter i 50-100 pi PBS per graft. Opret sårlejet på mus, vedhæfte kammer, og anvende celleblandingen at såre seng. Alternativ procedure beskriver Alternativ fremgangsmåde konturer vil afkorte proceduren fra fire dage til tre. <ol><li> Kombiner dag 1 og dag 2 ved at behandle mus skind i dispase ved 37 ° C i en time (anslåede tid 5-7 timer). </li><li> Kombiner Dag 2 og Dag 3 ved at inficere celler med lentivirus efter udpladning af celler i to timer (anslået tid 5-7 timer). </li></ol>

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Hår rekonstituering assays giver en unik orgel regenerering model til at undersøge den mekanisme af de novo hårsækken formation. Her beskriver vi en modificeret kammer hår assay anvendes til bestemmelse af genfunktion i hårsækken formation. Vores assay er baseret på den rapporterede kammer hår rekonstituering assay 5, 6,11, som vi ændret for at indføre en lentiviral udtryk teknik til at opnå genetisk overekspression eller knockdown i enten de dermale eller epidermale celletyper. Vores assay tilvejebringer en hurtig alternativ til generering af vævsspecifik genetisk knockout. Dette assay tillader os at påvise genfunktion i hårfollikel-dannelse i så lidt som tre uger inficerer primære celler med lentivirus til graft samling. Vores analyse kan udvides til at behandle genetiske interaktioner under anvendelse kombination shRNA / cDNA levering af lentivirus i én celletype 12, og tillader undersøgelse af signalering mellem den dermale og epidermale celler types. Vores hår assay er bedst egnet til at detektere stærke gevinst-eller tab af funktion fænotyper i hårsækken regenerering, mens subtile fejl er sværere at observere. Vi har med succes demonstreret dermal specifik genfunktion af nogle få gener ved hjælp af vores hår regenerering assay 1,12. Baseret på GFP-markør co-udtrykkes fra lentivirus vektor, der udtrykker shRNA 10, demonstrerede vi, at shRNA udtrykker donor dermale celler fastholdt de regenererede hår vin. GFP-positive celler var til stede i dermal papilla (DP) af de regenererede hårsækkene (figur 3). De DP-celler sandsynligvis bestod af forskellige gen-knockdown som celler udtrykte forskellige niveauer af GFP, således den observerede hårsækken fænotype var et område fra genetisk hypomorph til null. En forbedring for denne analyse vil være at etablere en hurtig og effektiv selektion for de høje shRNA udtrykkende celler før grafting, såsom anvendelse af FACS for at rense stærkt GFP-udtrykkende celler. Et alternativ er at erstatte mutant eller betinget knockout-celler i dette assay 9. På den anden side er en kultur, der kan bevare DP cellefunktion meget anvendelige som DP styrken gradvist går tabt, når det primære dermale celler er passage. Potentielle dyrkningssystemer indbefatter anvendelsen af biomaterialer fremstillet af kunstige niche eller aggregering kulturer 2,7,8,13. En anden forbedring består i at skabe en pålidelig epidermal cell frysemetode med en høj cell recovery rate da dette vil reducere anvendelsen af ​​det andet sæt af muse-unger (trin 7) til at generere nye keratinocytter i dermal-specifikt tab-eller gain-of- funktionsundersøgelser. Dette kammer hår assay producerer hårsækken tæthed og kvalitet svarer til normal musehud, selv hårvækst er lidt mindre synkroniseret og follicle orientering er mere tilfældig. Et par begrænsninger i håret regenerering genetisk analyse herune kravet om store mængder af lentivirus-og celleantal, og det er meget arbejdskrævende, hvad angår kirurgiske metoder i forhold til andre former for hår rekonstituering assays såsom plasteret og flap assays 3,4,14. Imidlertid er kvaliteten af hårsækkene og timeline at detektere hårvækst er bedre end andre assays 4. Vores målrettede hår regenerering assay giver en hurtig og bekvem ledsager til eksisterende genetiske modeller.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> Cell N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100-tillæg </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase, type 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Vævskulturskål </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Dissekere Scissors </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> buet </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Størrelse no. 10 </td></tr><tr><td> 70 pm cell Stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konisk centrifugerør </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Spritservietter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge nål </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye smøremiddel </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providon-Lodine svaberprøver </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30.268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturer </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Fleksible bandage </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke-klæbende forbinding </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vask løsning PBS 500 ug / ml penicillin / streptomycin 12,5 ug / ml Fungizone 100 ug / ml Gentamycin Dispase løsning HBSS 2,5 mg / ml endelig Dispase 100 ug / ml Gentamycin Neutraliserende medier HBSS 15% (volumen / volumen) FBS Collagenaseopløsning 0,25% (vægt / vol) collagenase, type 1 NDHOLDET &quot;&gt; 100 ug / ml penicillin / streptomycin 2,5 ug / ml Fungizone 50 ug / ml gentamycin Polybrene løsning HBSS 8 pg / ml (vægt / volumen) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Hårfollikel morfogenese, en kompleks proces, der kræver interaktion mellem epitel-afledte keratinocytter og det underliggende mesenchym, er et attraktivt modelsystem til at studere organudvikling og vævsspecifik signalering. Selvom hårsækken udvikling er genetisk medgørlig, hurtig og reproducerbar analyse af faktorer væsentlige for denne proces er fortsat en udfordring. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at frembringe målrettet overekspression eller shRNA-medieret knockdown af faktorer ved hjælp af lentivirus i en vævsspecifik måde. Anvendelse af en modificeret version af et hår regenerering model 5, 6, 11, kan vi opnå robuste gevinst-eller tab-af-funktions-analyse i primære musekeratinocytter eller dermale celler for at lette undersøgelse af epitel-mesenchymale signaleringsveje, der fører til hårsækken morfogenese . Vi beskriver, hvordan du isolerer friske primære musekeratinocytter og dermale celler, der indeholder dermal papilla celler og deres prækursorer, levere lentivirus contaidelsen enten shRNA eller cDNA med en af ​​cellepopulationer, og kombinere cellerne til at generere fuldt dannet hårsækkene på ryggen af ​​nøgne mus. Denne fremgangsmåde giver mulighed analyse af væv-specifikke faktorer, der er nødvendige for at generere hårsækkene inden for tre uger og giver en hurtig og bekvem følgesvend til eksisterende genetiske modeller.

I figur 1 viser vi resultatet af dermal-specifik lentiviral shRNA knockdown af Smoothened (Smo), en kritisk Shh signalering komponent, i en 3-uger gamle regenerativ hår graft. Kontroltransplantater anvender lentiviral vektor alene udviser robust hårvækst (figur 1A). Derimod. Dermal-specifik knockdown af SMO resulterer i tab af hårvækst (figur 1 B) Hematoxylin og eosinfarve viser den fase af hårsækkene i kontrol og eksperimentelle betingelser (figur 1C, D). Hårvækst fænotype fra lignende behandlinger kan være variabel blandt eksperimenter, herunder den positive kontrol med lentiviral vektor alene infektion. Derfor positive kontroltransplantater skal altid indgå i ethvert eksperiment som en reference som 30% af transplantater kan mislykkes som følge af ardannelse eller ufuldstændig fastgørelse af transplantater. I tilfælde af afprøvning af en interaktion mellem to faktorer som overudtrykker cDNA af en faktor til at rescue shRNA-medieret knockdown af en anden faktor, bør man altid omfatte knockdown alene transplantater at manifestere tabet af funktion resultat i hvert forsøg. Dette vil udgøre et nødvendigt område at bestemme, hvordan et bestemt gen foruroliger hårsækken regenerering vej, og hvordan to gener interagerer. Fjernelse af kammeret (figur 2A) skal udføres med omhu. Den nydannede graft bør være svagt uigennemsigtig med en mat overflade (figur 2B). Transplantatet kan klæbe til kammeret, så forsigtigt at løfte den ene side er vigtigt at sikre protesen forbliver fastgjort til sårlejet. Transplantatet er ganske stabil efter tre dage og skal præsentere lidt besvær, når du fjerner forbindingen. Robust hårvækst bør observeres efter tre uger (figur 2C). Udeladelse enten mDCs eller KCS vil resultere i et genvundet sårsted uden hår (fig. 2D) 11. Celledød eller celletab i en afcelletyper resulterer også i nogen håret i modsætning til reduceret hår regenerering i dermal-Smo knockdown som vist i figur 1B. For at sikre en vellykket assay, er det vigtigt at opnå mere end 90% viral infektion af celler med passende overekspression eller knockdown effektivitet, før podning. På grund af de tidsmæssige begrænsninger for podning procedure, anbefaler vi fejlfinding virusinfektion effektivitetsgevinster før du starter en podning eksperiment, og altid gemme en lille del af celler på dag podning procedure for at kontrollere tab eller gevinst-of-udtryk. Lentiviral titer vil variere afhængigt af konstruktionen anvendes og bør bestemmes før infektion for at opnå 90-100% effektivitet. Vi overvåger virusinfektion effektivitet med GFP co-udtrykkes fra den lentivirusvektor. Vi rutinemæssigt udfører kvantitativ PCR og / eller Western blot for at bestemme omfanget af knockdown eller overekspression. Udnytte dual-ekspressionsvektorer med fluorescerende tags at mærkeviralt inficerede celler er en måde at rapportere perdurance af signal og antallet af celler, der udtrykker vores konstruktioner i modne transplantater. Vi bruger GFP drevet af en CMV-promotor fra lentivirusvektoren pSicoR-CMV-GFP-10 i kombination med Smo shRNA. I figur 3, viser vi en 3 uger gammel dermal-specifik graft, hvor GFP er lentivirally-udtrykt i dermal papilla af en repræsentativ hårfollikel. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figur 1. Histologisk analyse af hår follicle vækst. (A) Se af kontrol hår regenerering graft med dermale celler inficeret med tomme lentiviral vektor og ubehandlede keratinocytter. (B) Smoothened knockdown hjælp lentiviral shRNA i dermale celler kombineret med ubehandlede keratinocytter resulterer i tab af hårsækkene. (C) hematoxylin og eosin-farvning viser anagent hår follicles i kontroltransplantater strækker sig ned i dermis og (D) Smoothened knockdown hårsækkene fortsat hæmmet og stort set fraværende. Alle billeder er tre uger efter podning. Scale bar betegner 100 um. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figur 2. Podning primære celler. (A) nu / nu mus med suturerede kammerhuset primære dermale celler og keratinocytter. (B) Fjernelse af kammer udsætter nydannede hud, der er kedelig og uigennemsigtig i karakter. (C) fuldvoksne hår på graft med vild- skrive primære dermale celler og keratinocytter i tre uger efter podning. (D) Tilsætning af primære dermale celler uden keratinocytter medfører ingen hår efter tre uger. Lignende resultater ses ved tilsætning af primære keratinocytter uden dermale celler. Figur 3. Vedligeholdelse af GFP-ekspression i dermal papilla. Konfokale billeder af dermal papilla fra et 3 uger gammelt regenereret graft. GFP blev udtrykt i den dermale cellepopulation fra en lentiviral vektor og detekteres i dermal papilla (grøn). Versican (rød) afgrænser den dermale papil og kerner blev mærket med Hoechst (blå). Bemærk GFP udtrykkes specifikt i dermale celler, men ikke i de omgivende keratinocytter. Scale bar betegner 20 um.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration (Video) | JoVE

Tissue-specifik analyse af en hårsæk regenerering model ved hjælp af lentivirus at mægle gain-eller tab af funktion.

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse (Video) | JoVE

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis (Video) | JoVE

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts (Video) | JoVE

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development (Video) | JoVE

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica (Video) | JoVE

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures (Video) | JoVE

Metabolisk mærkning og membranfraktionering for Komparativ proteomiske analyse af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair (Video) | JoVE

Udvinding og analyse af Cortisol fra menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images (Video) | JoVE

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

Påvisning af alternativ splejsning løbet Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis (Video) | JoVE

En ny teknik til kvantitativ analyse af hårtab i mus Brug gråtoner Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...