Name: rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) en NIH beurzen AR052785 en AR046786 (AEO en W.-MW).

1. Bereid 0 tot 2 dagen oud pasgeboren muizen voor Skin Dissection <ol><li> Euthanaseren muis pups met een CO 2 kamer gedurende ten minste 20 minuten. Laat pups op ijs tot een uur tot dissectie. P0-P2 muizen zijn zeer aan te bevelen als cellen bereid uit oudere muizen een verminderde progenitor capaciteit die leidt tot lagere transplantaat opbrengsten. Bereid een schotel van 70% ethanol (voor stap 1.3) en drie schotels van wasoplossing (voor stap 3) wanneer u klaar bent voor de huid dissectie uit te voeren. Ontdooi Dispase Solution en laat het bij 4 ° C. Cervicale ontwrichten pups na CO 2 te lange blootstelling aan euthanasie te garanderen. </li><li> Plaats euthanized pups in een cultuur schotel op ijs en overbrengen in een steriele zuurkast. </li><li> Was pups door kort onder te dompelen in 70% ethanol en plaats op steriele cultuur schotel. </li></ol> 2. Ontleden Mouse Huid <ol><li> Afgesneden alle ledematen en staart aan de basis van de romp met een steriele schaar. </li><li> Stevig vast lichaam tussen een paar cuGraco behoudt pincet en maak een incisie langs de dorsale huid van kop tot staart met behulp van een scalpel, zonder het penetreren van de onderliggende fascia. </li><li> Zorgvuldig verwijderen van de huid uit de buurt van de middellijn van de muis. </li><li> Stevig vastpakken van de blootgestelde muis met de lange zijde van de gekromde forceps en plaats een ander paar gebogen forceps onder de huid aan het achterste uiteinde van de muis huid voorzichtig stoppen heupen naar de ventrale helft van de muis. </li><li> Verwijder voorzichtig de huid helemaal van de muis in een vloeiende beweging en gooi het karkas. </li></ol> 3. Was de huid en het Incubate met Dispase Solution <ol><li> Plaats de huid in de eerste schotel van wasoplossing met dermis naar beneden. Spreid de huid uit en schud met een pincet. Laat de huid in de eerste schotel van wasoplossing terwijl het ontleden van de volgende huid. </li><li> Na het plaatsen van de volgende ontleed huid in de eerste schotel van wasoplossing, de overdracht van de voorafgaande huid aan de tweede schotel van wasoplossing. Houd skins in the seconde wasoplossing totdat alle huiden worden verzameld. Breng alle van de huiden van de laatste wasbeurt, kort schudden. </li><li> Voeg 10 ml ijskoud Dispase naar een steriele 10 cm cultuur schotel. Overdracht huid om de Dispase Solution en plat huid dermis naar beneden. </li><li> Zweven huid gedurende 8-16 uur bij 4 ° C (alternatief: 1 uur bij 37 ° C). </li></ol> 4. Aparte dermis en epidermis <ol><li> Overdracht huid om een ​​nieuwe steriele cultuur schotel en plat huid dermis naar beneden. Voorzichtig houd de dermis van de ene hoek met een scalpel. </li><li> Pak de epidermis met een tang en langzaam loskomen van de dermis. Epidermis moet afpellen als een stuk. De epidermis is wit en dun en de dermis moet bruinachtig, dikker, en gelatineachtige. </li><li> Scheid de twee weefsels in afzonderlijke steriele cultuur gerechten. <ol class="lalpha"><li> Om een ​​dermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft te maken, neem dermis en gehakt in heel kleine stukjes met two scalpels. Gooi epidermis. Op dag van infectie (stap 7), ontleden andere set muizen vellen aan verse onbehandelde epidermale cellen te combineren met lentivirale geïnfecteerde dermale cellen. </li><li> Om een ​​epidermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft te maken, snijd elk opperhuid in 6 tot 8 kleinere stukken. Gooi dermis. Op dag van infectie (stap 7), ontleden andere set muizen vellen aan verse onbehandelde huid cellen te combineren met lentivirale geïnfecteerde epidermale cellen. </li></ol></li></ol> 5. Distantiëren Primaire Muis Dermaal Cells (MDCs) van gehakt Tissue <ol><li> Dissociëren MDCs door incubatie dermale stukken met verse collagenaseoplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Gebruik 10 ml collagenase oplossing per muis pup. </li><li> Voorzichtig mengen oplossing die dermis om de 10 minuten. Controleer de mate van dissociatie onder een microscoop, de verkregen celsuspensie moet meestal enkele cellen. De oplossing moet veranderen van helder tot bewolkt zodermale cellen worden gescheiden van de dermis. </li><li> Toevoegen aan FBS collagenaseoplossing met dermis met 10% eindvolume de activiteit van collagenase verminderen. </li><li> Steek de celsuspensie door middel van een 70 pm cel zeef in een nieuwe 50 ml buis tot grote onverteerde massa&#39;s en hele follikels te verwijderen. Voeg 10 ml DMEM/10% FBS per 30 ml van de doorloop verder verdunnen collagenase. </li><li> Centrifuge buizen die verteerd dermis bij 30 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten om verder te verwijderen hele follikels. </li><li> Breng voorzichtig de supernatant naar een nieuwe 50 ml tube. Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen met DMEM/10% FBS (1 ml per pup) en tel cellen. Cellaag met AmnioMax C-100 media voor infectie (stap 7), of combineren met lentivirus geïnfecteerde KC voor enting (stap 9). Typische opbrengst is 20 x 10 6 cellen per pup. </li></ol> 6. Distantiëren Primaire keratinocytens (KC) van gehakt Tissue <ol><li> Dissociëren KC door incubatie epidermale stukken met vers ontdooid 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Gebruik 7 ml trypsine-EDTA per muis pup. </li><li> Zwenk oplossing die epidermis om de 5 minuten. </li><li> Voeg gelijke volume van neutraliserende oplossing aan trypsine-EDTA bevattende epidermis de activiteit van trypsine verminderen. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resterende onverteerd weefsel moet drijven op de top. </li><li> Giet het grootste deel van het supernatant met onverteerd weefsel. Resterende supernatant met een pipet 10 ml zonder storende cel pellet. Resuspendeer celpellet met PBS. Bij KCS niet volledig gepelleteerd, giet meeste supernatant en herhaal centrifugeren tot de meeste cellen gepelleteerd. </li><li> Zeef celsuspensie door middel van 70 pm cel zeef in een nieuwe buis om de resterende weefsel of klonten te verwijderen. </li><li> Pellet cellen door centrifugerenbij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in CNT-07 media of PBS (1 ml per pup) en tellen cellen. Gebruik CNT-07 voor plating cellen voor infectie (stap 7), met PBS om met lentivirus geïnfecteerde MDCs combineren enting (stap 9). Typische opbrengst 3-10 is x 10 6 cellen per pup. </li></ol> 7. Infect primaire cellen met Lentivirus met een gehalte shRNA of cDNA Op dag van infectie ontleden andere reeks muis vellen aan verse onbehandelde primaire KCS of MDCs te combineren met virus geïnfecteerde cellen op dag van enting (stap 9) te bereiden. <ol><li><ol class="lalpha"><li> Voor MDCs, plaat 4 x 10 6 MDCs per 10 cm plaat met AmnioMax-C100 media en incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende volgende dag infectie bij 50% celdichtheid. Gewoonlijk 3-4 platen MDCs worden gebruikt om een ​​ent genereren, en een totaal van 10-12 platen nodig om drie grafts in een experiment genereren. Als alternatief, laat MDCs hechten en verspreiden fof minimaal 2 uur bij 37 ° C + 5% CO2 en infectie dezelfde dag van cel plating voeren. MDCs zal fibroblast-achtige morfologie. </li><li> Voor KC, plaat 12 x 10 6 KC per 10-cm plaat met CNT-07 media en incubeer bij 37 ° C + 5% CO 2 voor de volgende dag infectie. Alternatief laat KC hechten en minimaal 2 uur uitgezaaid op 37 ° C + 5% CO2 en infectie op dezelfde dag voeren. Gewoonlijk 3-4 KC platen worden gebruikt om een ​​ent genereren. Een totaal van 10-12 platen nodig om drie grafts voor een experiment genereren. KCS zal geplaveide morfologie. </li></ol></li><li> Preincubate cellen gedurende 5-10 minuten met 8 pg / ml Polybreen oplossing bij 37 ° C + 5% CO2. </li><li> Uitwisselingsmedia en voeg lentivirus + 8 ug / ml Polybreen Solution. Lentivirale titer afhankelijk van het construct gebruikt en moeten vóór infectie. </li><li> Centrifugeer de platen bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 1 uur bij 32 °; C om cellen te infecteren met lentivirus. </li><li> Verwijder lentivirus-bevattende media en voeg vers medium. Voor KC, een keer wassen cellen met PBS voor het toevoegen van weer nieuwe media. Meestal geïnfecteerde cellen herstellen nacht bij 37 ° C + 5% CO2. Alternatief ten minste twee uur van terugwinning bij 37 ° C + 5% CO2 voordat trypsinizing de cellen grafts. Blijven cultuur een klein gedeelte van geïnfecteerde cellen op infecties efficiëntie zoals beschreven in de sectie Representatieve resultaten. </li></ol> 8. Bereid geïnfecteerde cellen voor enting <ol><li> Isoleer verse primaire MDCs of KCS van de huid met behulp van de stappen 4-6. Resuspendeer cellen in ijskoude steriele PBS. Tellen cellen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Voor dermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft, dissociëren geïnfecteerde MDCs van platen met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 8 min. </li><li> Voor epidermale specifiek gen knockdown / overexpressie graft, dissociëren geïnfecteerde KC platen van using 0,125% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol></li><li> Neutraliseren trypsine activiteit met DMEM + 10% FBS (MDCs) of neutraliserende oplossing (KC). Breng de getrypsiniseerde cellen in een 50 ml buis. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 200 xg op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in ijskoude steriele PBS. Tellen cellen. </li><li> Combineer de virus-geïnfecteerde cellen met de vers bereide onbehandelde tegenhanger celtype. Voor een graft te combineren 7-10 x 10 6 MDCs Met 7-10 x 10 6 KCS in ijskoud steriel PBS en de cel pellet slurry in een tafelblad centrifuge bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 50 -100 ul ijskoude steriele PBS. Houd cellen op ijs tot nu / nu muizen kamers klaar zijn. </li></ol> 9. Maak Wond Bed and Fix Kamer op Terug van nu / nu Muis Een dag voor het enten, steriliseren chirurgische instrumenten met autoclaaf en steriele silicium kamers door het weken in 70% ethanol. Vervang de 70% Ethanol met steriel PBS voordat u de kamers. <ol><li> Anesthetize nu / nu muizen (7-12 weken oud vrouwtjes) met ketamine (8 mg / ml) / xylazine (1,6 mg / ml) via intraperitoneale injectie (100 μl/10 g lichaamsgewicht) of andere voorkeur. Breng oog smeermiddel. Plaats verwarmingselement onder de muis. </li><li> Desinfecteer naakt muis terug huid met jodium en schoon met alcoholdoekjes. </li><li> Voeg 1-3 druppels 0,25% tot Bupivicaine incisie topisch. Knijp het naakt muis terug de huid aan de basis van de nek met een pincet. </li><li> Snij een klein rond gat (~ 1 cm in diameter) in huidplooi met een steriele schaar. </li><li> Plaats steriele kamer op wondbed en bedek kamer randen met de omliggende huid. </li><li> Beveiligde ruimte plaats met hechtingen langs randen kamer (6 steken per kamer) zoals getoond in figuur 2A. </li><li> Wanneer kamers klaar zijn, voorzichtig werveling cel slurry en stelt in 23 gauge naald grenst aan 1 ml spuit. Als cel drijfmest gecondenseerd onder voorzichtigresuspendeer met 1 ml pipet tip voor het opzuigen in de naald. </li><li> Prik kamer met naald en langzaam cellen druppelen wond. </li><li> Plaats muizen in schone, geautoclaveerd kooien. Huis 2 muizen per kooi en antibiotica en Tylenol (3 mg / ml) tot drinkwater voegen. In onze ervaring, hebben twee vrouwelijke muizen per kooi niet geleid tot ongunstige trauma aan de kamer, transplantaat, of dieren. </li><li> Plaats verwarmingskussen minder dan de helft van de kooi en observeer muizen tot verdoving is uitgewerkt. </li></ol> 10. Verwijder Kamer Na 7-9 dagen <ol><li> Verdoof chambered nu / nu muizen als in stap 9.1. Breng oog smeermiddel. </li><li> Desinfecteer de huid rond de kamer met jodium en schoon met alcoholdoekjes. </li><li> Knip voorzichtig steken en te verwijderen uit de kamer. </li><li> Verwijder voorzichtig de kamer van muis. Als er nieuwe huidtransplantatie stokken naar de kamer, tilt een deel van de kamer en voorzichtig gescheiden transplantaat uit de kamer met behulp van een tang. Houd graft naar beneden tijdens het verwijderen van de kamer. Graft moet look dof en ondoorzichtig als in figuur 2B. </li><li> Breng een niet-hechtende pad met een dunne film van antibiotica op de open wond en hechting plaats (2 st). </li><li> Wikkel verband rond de muis om de pad te beveiligen en de wond te beschermen. Hecht bandage op zijn plaats. </li><li> De silicium kamers worden gereinigd door wassen met zeep en grondig gespoeld met gedeïoniseerd water. Week de kamers in 70% ethanol &#39;s nachts, drogen aan de lucht, en op te slaan. </li></ol> 11. Onderzoek Muis voor haargroei <ol><li> Verwijder verbandmiddelen en pad na 3 dagen van de kamer verwijderen. Graft moet droog en ondoorzichtig tot bruin van kleur. </li><li> Controleer regelmatig muizen voor de haargroei. Haar moet beginnen om te laten zien op 16 dagen na de transplantatie. </li></ol> Procedure Outline Dag 1 (2-3 uur): Sacrifice pasgeboren pups, verwijder de huid, en laat op dispase bij 4 ° C gedurende de nacht. Dag 2 (2-3 uur): Isoleer primaire cellen van de huid enplaat bij de aanbevolen celdichtheid. Dag 3 (3-4 uur) Infect cellen met lentivirus. Verwijder het vel van een set van pasgeboren pups en vertrekken dispase bij 4 ° C overnacht. Dag 4 (6-8 uur): Isoleer primaire cellen van de huid, tellen, en laat op ijs. Herstel lentivirus geïnfecteerde cellen door trypsinisatie en centrifugeren, tellen en combineren 7-10 x 10 6 huidcellen en keratinocyten in 50-100 pi PBS per graft. Maak wondbed op de muis, hechten kamer, en van toepassing celmengsel naar bed gewikkeld. Alternatieve procedure wordt beschreven Alternatieve procedure hoofdlijnen verkort de procedure van vier dagen tot drie. <ol><li> Combineer dag 1 en dag 2 door behandeling muis achtergronden in dispase bij 37 ° C gedurende een uur (verwachte 5-7 uur). </li><li> Combineer dag 2 en dag 3 door cellen met lentivirus na uitplaten cellen gedurende twee uur (geschatte tijd 5-7 uur). </li></ol>

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hair reconstitutie testen leveren een uniek orgel regeneratie model voor het onderzoek van het mechanisme van de novo haarfollikel formatie. Hier beschrijven we een gemodificeerde assay kamer haar bruikbaar voor het bepalen van genfunctie in haarfollikel formatie. De assay is gebaseerd op de gerapporteerde kamer haar reconstitutie assay 5, 6,11, die we aangepast om een lentivirale expressie techniek om overexpressie van de genen of knockdown bereiken via de huid of epidermale celtypes voeren. De assay is een snelle alternatief voor weefsel-specifieke genetische knockout genereren. Deze test laat ons toe om genfunctie te tonen in haarfollikel vorming in zo weinig als drie weken na het infecteren van primaire cellen met lentivirus te enten collectie. De assay kan worden uitgebreid tot genetische interacties met combinatie shRNA / cDNA bezorging lentivirus in een cel type 12 te pakken, en maakt onderzoek van signalering tussen de dermale en epidermale cel types. Ons haar test is het meest geschikt voor het opsporen van sterke winst-of verlies-van-functie fenotypes in haarfollikel regeneratie, terwijl subtiele gebreken zijn moeilijker te observeren. We hebben met succes aangetoond dermale specifiek gen functie van een aantal genen met behulp van ons haar regeneratie test 1,12. Gebaseerd op de GFP marker co-expressie van lentivirus vector die shRNA 10 hebben we aangetoond dat de shRNA tot expressie donor dermale cellen bleven in de geregenereerde grafts. GFP-positieve cellen aanwezig waren in de huidpapil (DP) van de geregenereerde haarfollikels (figuur 3). De DP cellen waarschijnlijk bestond uit verschillende gen knockdown als cellen brachten verschillende niveaus van GFP, waardoor het waargenomen fenotype haarzakje een bereik van genetische hypomorph op nul. Een verbetering voor deze test zal zijn om een ​​snelle en efficiënte selectie voor de hoge shRNA expressie brengende cellen vast te stellen voordat Grafting zoals het gebruik van FACS sterke GFP tot expressie brengende cellen te zuiveren. Als alternatief kunnen mutante of voorwaardelijke knockout cellen vervangen in deze assay 9. Anderzijds, een kweeksysteem dat DP celfunctie kan bewaren is zeer geschikt als DP vermogen geleidelijk verloren als de primaire dermale cellen gepasseerd. Potentiële cultuur systemen omvatten het gebruik van biomaterialen afgeleid van kunstmatige niche of aggregatie culturen 2,7,8,13. Een andere verbetering is om een ​​betrouwbare epidermale cel bevriezingsmethode met een hoge cell rate recovery omdat dit het gebruik van de tweede reeks muis pups (stap 7) verminderen verse keratinocyten in de huid-specifieke verlies of te genereren gain-of- functie studies. Deze kamer haren assay produceert haarfollikel dichtheid en kwaliteit vergelijkbaar met een normale muis huid, hoewel haargroei is iets minder gesynchroniseerd en follikel oriëntatie is meer willekeurig. Een paar beperkingen van de regeneratie van haar genetische test include het vereiste van grote hoeveelheden lentivirus en aantal cellen, en het is zeer arbeidsintensief qua chirurgische methoden in vergelijking met andere vormen van haar reconstitutie assays zoals de patch en flap assays 3,4,14. Echter, de kwaliteit van de haarzakjes en tijdlijn om de haargroei te detecteren is superieur aan andere testen 4. Onze doelgerichte haar regeneratie test zorgt voor een snelle en handige metgezel van bestaande genetische modellen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Cel N Tec </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybreen </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Weefselkweekplaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Ontleden Schaar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11 tot 999 </td><td></td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10 tot 275 </td><td> gebogen </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Grootte nee. 10 </td></tr><tr><td> 70 pm cel Stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische centrifugebuis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Alcoholdoekjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye smeermiddel </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Jodium swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Hechtingen </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Flexibele bandage </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Niet-verklevend verband </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materieel </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Wasoplossing PBS 500 ug / ml penicilline / streptomycine 12,5 pg / ml Fungizone 100 ug / ml gentamycine Dispase oplossing HBSS 2,5 mg / ml uiteindelijke Dispase 100 ug / ml gentamycine Neutraliserende media HBSS 15% (v / v) FBS Collagenaseoplossing 0,25% (w / v) Collagenase, Type 1 NHOUD &quot;&gt; 100 ug / ml penicilline / streptomycine 2,5 ug / ml Fungizone 50 ug / ml gentamycine Polybreen oplossing HBSS 8 ug / ml (w / v) Polybreen </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Haarfollikel morfogenese, een complex proces dat interactie tussen epithelia afgeleide keratinocyten en de onderliggende mesenchym, een aantrekkelijke modelsysteem orgaanontwikkeling en weefsel-specifieke signalen bestuderen. Hoewel haarfollikel ontwikkeling is genetisch handelbaar, snel en reproduceerbare analyse van factoren die essentieel zijn voor dit proces blijft een uitdaging. Hier beschrijven we een procedure gerichte overexpressie of shRNA-gemedieerde knockdown van factoren met lentivirus in een weefsel-specifieke wijze genereren. Met behulp van een aangepaste versie van een haar regeneratie model 5, 6, 11, kunnen we robuuste winst-of verlies-van-functie analyse in primaire muis keratinocyten of dermale cellen studie van epitheliale-mesenchymale signaalwegen die leiden tot haarfollikel morfogenese te vergemakkelijken . We beschrijven hoe de frisse primaire muis keratinocyten en dermale cellen, die dermal papilla cellen en hun voorlopers bevatten isoleren, leveren lentivirus containing of shRNA of cDNA van een van de celpopulaties en combineren de cellen volledig gevormd haarzakjes op de rug van naakt muizen te genereren. Deze aanpak maakt het mogelijk de analyse van weefsel-specifieke factoren die nodig zijn om de haarzakjes te genereren binnen drie weken en biedt een snelle en handige metgezel van de bestaande genetische modellen.

In figuur 1 tonen we het resultaat van dermale specifieke shRNA lentivirale knockdown van Smoothened (Smo), een kritische component Shh signalering, in een 3 weken oude regeneratieve haar graft. Controle enten met behulp van lentivirale vector alleen tonen robuuste haargroei (Figuur 1A). Daarentegen dermale-specifieke knockdown van Smo resulteert in verlies van haargroei (Figuur 1B). Hematoxyline en eosine kleuring toont het stadium van haarfollikels in controle en experimentele omstandigheden (figuur 1C, D). De haargroei fenotype van soortgelijke behandelingen kunnen variabel worden onder experimenten, met inbegrip van de positieve controle met lentivirale vector alleen infectie. Daarom positieve controle grafts moet altijd worden opgenomen in elk experiment als referentie 30% van transplantaten kan mislukken als gevolg van littekenvorming of onvolledige hechting van transplantaten. Bij het testen van een wisselwerking tussen twee factoren als overexpressie cDNA van een factor opnieuwscue shRNA-gemedieerde knockdown van een andere factor, moet men altijd zijn knockdown alleen enten te manifesteren het verlies-van-functie resulteert in elk experiment. Dit zal een noodzakelijke aantal te bepalen hoe een bepaald gen de haarfollikel regeneratie pathway en dat twee genen interactie verstoort. Verwijdering van de kamer (Figuur 2A) moet met zorg. De nieuw gevormde enten iets ondoorschijnend dof oppervlak (Figuur 2B). Het transplantaat kan aan de kamer, zodat voorzichtig op te tillen een zijde is belangrijk dat het implantaat blijft aan het wondbed. De ent is redelijk stabiel na drie dagen en moet weinig moeite te presenteren bij het verwijderen van het verband. Robuuste haargroei opgemerkt na drie weken (figuur 2C). Het weglaten of MDCs of KCS zal resulteren in een herstelde wond zonder haar (figuur 2D) 11. Celdood of celverlies in een van deceltypen ook tot geen haar, in tegenstelling tot verminderde haar regeneratie in dermale-Smo knockdown zoals getoond in figuur 1B. Op een geslaagd assay, is het essentieel om meer dan 90% bereiken virale infectie van cellen met geschikte overexpressie of knockdown efficiëntie voor enten. Vanwege de beperkte tijd van de enten procedure, raden wij aan het oplossen van problemen virale infectie-efficiëntie voor het starten van een experiment enten, en altijd een klein deel van de cellen op te slaan op de dag van enten procedure om het verlies-of gain-of-expressie te controleren. Lentivirale titer afhankelijk van het construct gebruikt en moeten vóór infectie 90-100% efficiëntie. Wij monitoren virale infectie-efficiëntie met GFP tezamen tot expressie gebracht van de lentivirale vector. We routinematig kwantitatieve PCR en / of Western blot de omvang van knockdown of overexpressie bepalen. Gebruik te maken van dual-expressievectoren met fluorescente labels te labelenviraal geïnfecteerde cellen biedt een manier om perdurance signaal en het aantal cellen die in onze constructen mature grafts geven. We gebruiken GFP aangedreven door een CMV promoter van de lentivirale vector pSicoR-CMV-GFP 10 in combinatie met Smo shRNA. In figuur 3 tonen wij een 3-weken oude dermale specifieke graft wanneer GFP-expressie in lentivirally huidpapilla een representatieve haarfollikel. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figuur 1. Histologische analyse van haarzakje groei. (A) Bekijk controle haar regeneratie transplantaat met dermale cellen die zijn geïnfecteerd met lege lentivirale vector en onbehandeld keratinocyten. (B) Smoothened knockdown met behulp van lentivirale shRNA in huidcellen in combinatie met onbehandelde keratinocyten resulteert in het verlies van haarfollikels. (C) Hematoxyline en eosine kleuring toont anagene follicles in controle grafts uit te breiden tot in de lederhuid en (D) Smoothened knockdown haarzakjes blijven onvolgroeid en grotendeels afwezig. Alle beelden zijn drie weken na transplantatie. Schaalbalk geeft 100 pm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figuur 2. Enten primaire cellen. (A) nu / nu muizen met gehecht tweekamerbehuizing primaire dermale cellen en keratinocyten. (B) Verwijdering van de kamer onthullingen nieuw gevormde huid die dof en ondoorzichtig karakter. (C) Volgroeid haren op graft met wild- Lager huidcellen en keratinocyten drie weken na transplantatie. (D) toevoeging van primaire dermale cellen zonder keratinocyten leidt tot geen haar na drie weken. Vergelijkbare resultaten zijn gezien met toevoeging van primaire keratinocyten zonder dermale cellen. Figuur 3. Onderhoud van GFP-expressie in dermal papilla. Confocale beelden van dermal papilla van een 3-weken oude geregenereerd graft. GFP expressie werd gebracht in de huid celpopulatie uit een lentivirale vector en gedetecteerd in de huidpapil (groen). Versican (rood) bakent de dermal papilla en kernen waren label met Hoechst (blauw). Opmerking GFP wordt specifiek tot expressie in dermale cellen maar niet in het omliggende keratinocyten. Schaalbalk geeft 20 urn.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Weefsel-specifieke analyse van een haarfollikel regeneratie model met behulp van lentivirus tot winst-of verlies-van-functie bemiddelen.

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Een nieuwe techniek voor de kwantitatieve analyse van haaruitval in Muizen met behulp van grijstinten Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...