Name: rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) og NIH tilskudd AR052785 og AR046786 (AEO og W.-MW).

1. Forbered 0-2 dager gamle nyfødte mus for Skin Dissection <ol><li> Avlive mus pups hjelp en CO 2 kammer i minst 20 min. La unger på isen opp til en time før disseksjon. P0-P2 mus er sterkt anbefalt som celler preparert fra eldre mus har redusert stamfar kapasitet som resulterer i lavere pode avkastning. Forbered en tallerken av 70% etanol (for trinn 1.3) og tre retter av vaskeløsning (for trinn 3) når du er klar til å utføre hud disseksjon. Tine Dispase Solution og la den ved 4 ° C. Cervical forrykke valpene etter CO 2 overeksponering for å sikre aktiv dødshjelp. </li><li> Plasser euthanized unger i en kultur tallerken på isen og overføring til et sterilt flyt hette. </li><li> Vask valper etter kort leve i 70% etanol og sted på sterilt kultur parabolen. </li></ol> 2. Dissekere Mouse Skin <ol><li> Avskåret hver lem og halen ved foten av torso med steril saks. </li><li> Gripe kroppen fast mellom et par av curved tang og gjør et snitt langs dorsal huden fra hode til hale med en skalpell uten å trenge den underliggende fascia. </li><li> Nøye skrelle huden vekk fra midtlinjen av musen. </li><li> Ta tak i utsatt musen fast med den ene langsiden av de buede tang og setter inn en par buede tang under huden på bakre enden av musen og dra forsiktig huden over hoftene mot ventrale halvdelen av musen. </li><li> Nøye skrelle huden helt av musen i en jevn bevegelse og kast skrotten. </li></ol> 3. Vask hud og Inkuber med Dispase Solution <ol><li> Plasser huden i første parabolen vaskeløsning med dermis-ned. Spre huden ut og rist med tang. La huden i første parabolen vaskeløsning mens dissekere den neste huden. </li><li> Etter å ha plassert den neste dissekert hud i første parabolen vaskeløsning, overføre forut huden til andre rett vaskeløsning. Hold skins i the andre vaskeløsning til alle skins er samlet. Overføre alle skinnene til den endelige vask, agitere kort. </li><li> Tilsett 10 ml iskald Dispase til et sterilt 10 cm kultur parabolen. Overfør huden til Dispase Solution og flat hud dermis-ned. </li><li> Float huden 8-16 timer ved 4 ° C (alternativ: 1 time ved 37 ° C). </li></ol> 4. Separat dermis og epidermis <ol><li> Overføre huden til en ny steril kultur parabol og flat hud dermis-ned. Hold forsiktig ned dermis fra ett hjørne med en skalpell. </li><li> Grip epidermis med pinsett og langsomt skrelle bort fra dermis. Epidermis bør skrelle bort som ett stykke. Epidermis vil være hvit og tynn og dermis skal være brunlig, tykkere, og geléaktige. </li><li> Skill de to vev i separate sterile kultur retter. <ol class="lalpha"><li> Å lage en dermal spesifikt gen knockdown / overexpression pode, ta dermis og hakke i veldig små biter med two skalpeller. Kast epidermis. På dag for infeksjon (trinn 7), dissekere et annet sett med mus skins å forberede ferske, ubehandlede epidermal cellene å kombinere med lentiviral-infiserte dermal celler. </li><li> For å gjøre en epidermal spesifikt gen knockdown / overexpression pode, skal du kutte epidermis inn 6-8 mindre biter. Kast dermis. På dag for infeksjon (trinn 7), dissekere et annet sett med mus skins å forberede ferske, ubehandlede dermale celler å kombinere med lentiviral-infiserte epidermal cellene. </li></ol></li></ol> 5. Distansere hovedknappen Dermal Cells (mDCs) fra kjøttdeig Tissue <ol><li> Dissosierer mDCs ved inkubering dermal stykker med ferske collagenase Solution ved 37 ° C i 1 time. Bruke 10 ml collagenase Solution per mus valp. </li><li> Bland forsiktig løsning som inneholder dermis hvert 10 min. Kontroller omfanget av dissosiasjon under et mikroskop, og den fordøyde cellesuspensjonen bør være mest enkeltceller. Løsningen bør endre fra klar til skyet somdermal celler er dissosiert fra dermis. </li><li> Legg FBS til kollagenase oppløsning inneholdende dermis til en 10% sluttvolum for å redusere aktiviteten av kollagenase. </li><li> Passere cellesuspensjonen gjennom en 70 um celle sil inn i en ny 50 ml rør for å fjerne store ufordøyd klumper og hele follikler. Tilsett 10 ml DMEM/10% FBS pr 30 ml av gjennomstrømningskanalen til ytterligere fortynne kollagenase. </li><li> Sentrifugerør inneholder fordøyd dermis ved 30 xg på et bord sentrifuger i 5 min for ytterligere å fjerne hele follikler. </li><li> Nøye overføre supernatanten til et nytt 50 ml rør. Pellet celler ved sentrifugering ved 200 xg i en bordplate sentrifuge i 5 min. </li><li> Resuspender celler med DMEM/10% FBS (1 ml per valp) og telle celler. Plate celler med Amniomax C-100 media for infeksjon (trinn 7), eller kombinere med lentivirus-infiserte KC for pode (trinn 9). Typisk avkastning er 20 x 10 6 celler per valp. </li></ol> 6. Distansere Primær keratinocytes (KC) fra kjøttdeig Tissue <ol><li> Dissosierer KC ved inkubering epidermale stykker med ferskt tint 0,05% Trypsin-EDTA ved 37 ° C i 15 min. Bruk 7 ml av trypsin-EDTA per mus pup. </li><li> Snurr løsning som inneholder epidermis hver 5 min. </li><li> Legg likt volum av nøytraliserende løsning Trypsin-EDTA inneholdende epidermis å redusere aktiviteten av trypsin. </li><li> Pellet celler ved sentrifugering ved 200 xg i en bordplate sentrifuge i 5 min. Gjenværende ufordøyd vev bør flyte på toppen. </li><li> Forsiktig helle av det meste av supernatanten med ufordøyd vev. Fjerne gjenværende supernatant med en 10 ml pipette uten forstyrrende cellepellet. Resuspender cellepellet med PBS. I tilfelle KCs ikke pelletisert helt, hell av mesteparten av supernatanten og gjenta sentrifugering inntil det meste av cellene er pelletert. </li><li> Sil cellesuspensjon gjennom 70 um celle sil i et nytt rør for å fjerne resterende vev eller klumper. </li><li> Pellet cellene ved sentrifugeringved 200 xg på et bord sentrifuger i 5 min. </li><li> Resuspender celler i CnT-07 media eller PBS (1 ml per valp) og telle celler. Bruk CnT-07 for plating celler for infeksjon (trinn 7), bruk PBS å kombinere med lentivirus-infiserte mDCs for pode (trinn 9). Typisk avkastning er 3-10 x 10 6 celler per valp. </li></ol> 7. Infisere primære celler med Lentivirus som inneholder shRNA eller cDNA På dagen for infeksjon dissekere et annet sett med mus skins å forberede ferske, ubehandlede primære KCs eller mDCs å kombinere med virus-infiserte celler på dagen pode (trinn 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> For mDCs, plate 4 x 10 6 mDCs per 10-cm plate med AmnioMAX-C100 medier og inkuber ved 37 ° C + 5% CO 2 for neste dag infeksjon ved 50% celletetthet. Vanligvis 3-4 plater av mDCs brukes til å generere en pode, og totalt 10-12 plater er nødvendig for å generere tre grafts i ett eksperiment. Alternativt, la mDCs feste og spre feller minimum 2 timer ved 37 ° C + 5% CO 2 og utføre infeksjon samme dag av celle platekledning. mDCs vil ha fibroblast-lignende morfologi. </li><li> For KC, plate 12 x 10 6 KC per 10-cm plate med CNT-07 media og Inkuber ved 37 ° C + 5% CO 2 for neste dag infeksjon. Alternativt, la KC feste og spre i minimum 2 timer ved 37 ° C + 5% CO 2 og utføre infeksjon på samme dag. Vanligvis 3-4 plater av KC brukes til å generere en pode. Totalt 10-12 plater er nødvendig for å generere tre grafts for ett eksperiment. KCs vil ha cobblestone morfologi. </li></ol></li><li> Preincubate celler for 5-10 min med 8 ug / ml polybren Solution ved 37 ° C + 5% CO 2. </li><li> Utveksling media og legge lentivirus + 8 mikrogram / ml polybren Solution. Lentiviral titer vil variere avhengig konstruere brukt og bør bestemmes før infeksjon. </li><li> Sentrifuger platene ved 200 xg i en bordplate sentrifuge i 1 time ved 32 °, C for å infisere celler med lentivirus. </li><li> Fjern lentivirus-holdige medier og legge friske medier. For KC, vask celler gang med PBS før du legger tilbake frisk medier. Sendes infiserte celler gjenopprette natten ved 37 ° C + 5% CO 2. Alternativt tillater minst to timer for utvinning ved 37 ° C + 5% CO 2 før trypsinizing cellene for grafts. Gå til kultur en liten del av infiserte celler for å sjekke for infeksjon effektivitet som beskrevet i representative resultater delen. </li></ol> 8. Forbered infiserte celler for Pode <ol><li> Isolere friske primære mDCs eller KCS fra huden ved hjelp av trinn 4-6. Resuspender celler i iskald sterilt PBS. Telle celler. </li><li><ol class="lalpha"><li> For dermal spesifikt gen knockdown / overekspresjon pode, dissosiere infiserte mDCs fra platene ved hjelp av 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 8 min. </li><li> For epidermal spesifikt gen knockdown / overexpression pode, distansere infiserte KC fra platene USIng 0,125% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 15 min. </li></ol></li><li> Nøytralisere trypsinaktivitet hjelp DMEM + 10% FBS (mDCs) eller nøytraliserende Solution (KC). Overfør trypsinert cellene til en 50 ml rør. </li><li> Pellet celler ved sentrifugering ved 200 xg i en bordplate sentrifuge i 5 min. </li><li> Resuspender celler i iskald sterilt PBS. Telle celler. </li><li> Kombiner virus-infiserte celler med nylagde ubehandlet motstykke celletype. For en pode, kombinere 7-10 x 10 6 mDCs med 7-10 x 10 6 KCs i iskaldt sterilt PBS og pellet cellen oppslemmingen i en tabletop sentrifuge ved 4 ° C. Resuspender celler i 50 -100 ul iskald steril PBS. Holde cellene på is inntil nu / nu mus kamre er klare. </li></ol> 9. Lag Wound Bed and Fix Chamber på baksiden av nu / nu Mouse En dag før pode, sterilisere kirurgisk verktøy med autoklav og sterilt silisium kamre av soaking i 70% etanol. Erstatte 70% etaNol med sterilt PBS før bruk kamrene. <ol><li> Anesthetize nu / nu mus (7-12 uker gamle hunner) med ketamin (8 mg / ml) / xylazin (1,6 mg / ml) via intraperitoneal injeksjon (100 μl/10 g kroppsvekt) eller andre foretrukne metode. Påfør øye smøremiddel. Sted oppvarming pad under musen. </li><li> Desinfisere naken mus tilbake huden med jod og rengjøre med spritservietter. </li><li> Legg 1-3 dråper 0,25% Bupivicaine til innsnitt området topically. Knip naken musen tilbake huden på undersiden av halsen med tang. </li><li> Skjær et lite sirkulært hull (~ 1 cm i diameter) i klem huden med steril saks. </li><li> Plasser steril kammer på såret og dekke kammer kantene med omkringliggende hud. </li><li> Sikre kammer på plass med sting langs kammer kanter (6 masker pr kammeret) som vist i Figur 2A. </li><li> Når kamre er klar, forsiktig virvel celle slurry og trekke opp i 23 gauge nål festet til 1 ml sprøyte. Hvis celle oppslemming har kondensert på bunnen, forsiktigresuspender med 1 ml pipette tips før tegning i nålen. </li><li> Punktering kammer med nål og sakte dryppe celler på såret. </li><li> Sted mus i en ren, autoklaveres merder. House 2 mus pr bur og legge antibiotika og Tylenol (3 mg / ml) til drikkevann. I vår erfaring har to hunnmus per bur ikke resultert i negativ traumer til kammeret, pode, eller dyr. </li><li> Plasser oppvarming pad under halvparten av buret og observere mus til anestesi slites av. </li></ol> 10. Fjern Chamber Etter 7-9 dager <ol><li> Anesthetize chambered nu / nu mus som i trinn 9.1. Påfør øye smøremiddel. </li><li> Desinfiser huden rundt kammer med jod og rengjøre med spritservietter. </li><li> Skjær forsiktig masker og fjerne fra kammeret. </li><li> Forsiktig fjerne kammer fra mus. Hvis nye hud pode pinner til kammeret, løft del av kammeret og forsiktig adskilt pode fra kammer med tang. Hold pode ned under fjerning av kammeret. Graft skal look kjedelig og ugjennomsiktig som i figur 2B. </li><li> Bruk et ikke-klebende puten med en tynn film av antibiotika på det åpne såret og sutur på plass (2 masker). </li><li> Pakk bandasje rundt musen til å sikre puten og beskytte såret. Suture bandasje på plass. </li><li> Silisium kamre blir rengjort ved å skrubbe med mild såpe og skylles grundig med avionisert vann. Suge kamrene i 70% etanol over natten, lufttørke, og butikken. </li></ol> 11. Undersøke Mouse for hårvekst <ol><li> Fjern bandasjer og pad etter 3 dager av kammer fjerning. Pode skal være tørr og ugjennomsiktig til brun i fargen. </li><li> Sjekk mus med jevne mellomrom for hårvekst. Håret bør begynne å vise på 16 dager etter pode. </li></ol> Prosedyre Outline Dag 1 (2-3 timer): Ofre nyfødte valper, fjerne hud, og la på dispase ved 4 ° C over natten. Dag 2 (2-3 timer): Isoler primære celler fra huden ogplate ved anbefalt celle tetthet. Dag 3 (3-4 timer): infisere celler med lentivirus. Fjern skinnet fra et annet sett av nyfødte unger og la på dispase ved 4 ° C over natten. Dag 4 (6-8 timer): Isoler primære celler fra huden, telle, og la på is. Gjenopprette lentivirus-infiserte celler ved trypsinisering og sentrifugering, telle, og kombinere 7-10 x 10 6 dermal celler og keratinocytter i 50-100 ul PBS per pode. Lag sårbunnen på musen, fest kammer, og gjelder celleblanding å såre seng. Alternativ prosedyre Outlines Alternative prosedyre skisserer vil forkorte prosedyren fra fire dager til tre. <ol><li> Kombiner dag 1 og dag 2 ved å behandle mus skins i dispase ved 37 ° C i en time (beregnet tid 5-7 timer). </li><li> Kombiner Dag 2 og dag 3 ved å infisere celler med lentivirus etter plating celler i to timer (beregnet tid 5-7 timer). </li></ol>

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Hår reconstitution analyser gir en unik organ gjenfødelse modell for å undersøke mekanismen av de novo hårsekken formasjon. Her beskriver vi en modifisert kammer hår assay nyttig for å bestemme genfunksjon i hårsekken formasjon. Vår analysen er basert på den rapporterte kammer håret rekonstituering assay 5, 6,11, som vi modifisert for å introdusere en lentiviral uttrykk teknikk for å oppnå genet overekspresjon eller knockdown i enten dermal eller epidermal celletyper. Vår analyse gir en rask alternativ til å generere vev-spesifikk genetisk knockout. Denne analysen kan vi demonstrere gen-funksjon hos hårsekken formasjonen i så lite som tre uker fra å infisere primære celler med lentivirus å pode samling. Vår Analysen kan bli utvidet til å adressere genetiske interaksjoner med kombinasjon shRNA / cDNA produksjonstid ved lentivirus inn en celletype 12, samt tillater undersøkelse av signalering mellom dermal og epidermal celle types. Vårt hår analysen er best egnet for å oppdage sterke gevinst-eller tap av funksjon fenotyper i hårsekken gjenfødelse, mens subtile feil er vanskeligere å observere. Vi har demonstrert dermal spesifikt gen funksjon av noen få gener ved hjelp av vår hår regenerasjon analysen 1,12. Basert på GFP markør co-uttrykt fra lentivirus vektor uttrykker shRNA 10, viste vi at shRNA uttrykker donor dermal celler fortsatte i de regenererte hår grafts. GFP-positive celler var tilstede i dermal papilla (DP) på de regenererte hårsekkene (Figur 3). DP cellene sannsynlig besto av ulike nivåer av genet knockdown som celler uttrykt varierende grad av GFP, og dermed den observerte hårsekken fenotypen var et utvalg fra genetisk hypomorph til null. Én forbedring for denne analysen vil være å etablere en rask og effektiv seleksjon for de høye shRNA uttrykkende celler før grafting for eksempel ved hjelp FACS å rense sterke GFP-uttrykke celler. Et alternativ er å erstatte mutant eller betinget knockout celler i denne analysen 9. På den annen side, er en kultur-system som kan bevare DP cellefunksjon svært nyttig som DP potens er gradvis tapt når de primære dermal celler passaged. Potensielle kultur systemer inkluderer bruk av biomaterialer avledet fra kunstig nisje eller aggregering kulturer 2,7,8,13. En annen forbedring vil være å generere en pålitelig epidermal celle frysemetode med høy celle utvinningsgrad da dette vil redusere bruken av det andre settet med mus valpene (trinn 7) for å generere nye keratinocytter i dermal-spesifikke tap-eller gevinst-of- funksjon studier. Dette kammeret hår analysen produserer hårsekken tetthet og kvalitet som ligner vanlig mus huden, selv om hårvekst er noe mindre synkronisert og hårsekken orientering er mer tilfeldig. Noen begrensninger i håret gjenfødelse genetisk analyse inklue kravet av store mengder lentivirus og antall celler, og det er svært arbeidsintensiv i form av kirurgiske metoder når sammenlignet med andre former for hår blandingsprosedyrer assays som plasteret og klaff analysene 3,4,14. Imidlertid er kvaliteten på hårsekkene og tidslinje for å oppdage hårvekst overlegen andre analyser 4. Vår målrettet hår regenerasjon analysen gir en rask og praktisk følgesvenn til eksisterende genetiske modeller.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Selskapet </td><td> Katalogisere # </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> Cell N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase, type 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybren </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Vevskultur parabolen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Dissecting saks </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> buet </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> MEDEX forsyning </td><td> GRF-2975 nr. 10 </td><td> Størrelse nei. 10 </td></tr><tr><td> 70 mikrometer celle Stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konisk sentrifugerør </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49d </td><td></td></tr><tr><td> Spritservietter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge nål </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye smøremiddel </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-lodine vattpinner </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturer </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Fleksibel bandasje </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke-klebende bandasje </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vask løsning PBS 500 ug / ml penicillin / streptomycin 12,5 mikrogram / ml Fungizone 100 ug / ml Gentamycin Dispase løsning HBSS 2,5 mg / ml endelig Dispase 100 ug / ml Gentamycin Nøytraliserende media HBSS 15% (v / v) FBS Collagenase løsning 0,25% (w / v) kollagenase, type 1 ontent &quot;&gt; 100 ug / ml penicillin / streptomycin 2,5 mikrogram / ml Fungizone 50 ug / ml Gentamycin Polybren løsning HBSS 8 mikrogram / ml (vekt / volum) polybren </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Hårsekken morphogenesis, en kompleks prosess som krever samhandling mellom epitel-avledet keratinocytter og den underliggende mesenchyme, er en attraktiv modell for å studere orgel utvikling og vev-spesifikk signalering. Selv hårsekken utvikling er genetisk medgjørlig, rask og reproduserbar analyse av faktorer avgjørende for denne prosessen er fortsatt en utfordring. Her beskriver vi en prosedyre for å generere målrettet overekspresjon eller shRNA-mediert knockdown faktorer som bruker lentivirus i en vev-spesifikk måte. Ved hjelp av en modifisert versjon av et hår regenerasjon modell 5, 6, 11, kan vi oppnå robust gevinst-eller tap av funksjon analyse i grunnskolen mus keratinocytter eller dermal celler for å lette studie av epitelial-mesenchymale signalveier som fører til hårsekken morphogenesis . Vi beskriver hvordan du isolerer ferske primære mus keratinocytter og dermal celler, som inneholder dermal papilla celler og deres forløpere, levere lentivirus containing enten shRNA eller cDNA til en av cellepopulasjoner, og kombinere cellene å generere fullt dannet hårsekkene på ryggen av nakne mus. Denne tilnærmingen gjør analyse av vev-spesifikke faktorer som kreves for å generere hårsekkene innen tre uker, og gir en rask og praktisk følgesvenn til eksisterende genetiske modeller.

I figur 1 viser vi resultatet av dermal-spesifikk lentiviral shRNA knockdown av mykgjorte (SMO), en kritisk Shh signalering komponent, i en 3-ukers gamle regenerativ hår pode. Kontroll grafts ved hjelp lentiviral vektor alene viser robust hårvekst (figur 1A). Derimot, dermal-spesifikk knockdown av SMO resulterer i tap av hårvekst (figur 1B). Hematoxylin og eosin flekken viser scenen av hårsekkene i kontroll og eksperimentelle betingelser (Figur 1C, D). Hårvekst fenotype fra lignende behandlinger kan være variabel blant eksperimenter, inkludert den positive kontroll med lentiviral vektor alene infeksjon. Derfor positive kontrollprøver grafts bør alltid være inkludert i hver eksperiment som en referanse som 30% av grafts kan svikte som følge av arrdannelse eller ufullstendig feste grafts. I tilfelle av testing en interaksjon mellom to faktorer som overekspresjon cDNA av en faktor for å rescue shRNA-mediert knockdown av en annen faktor, bør man alltid inkludere knockdown alene grafts å manifestere tap-av-funksjon resultat i hvert forsøk. Dette vil gi et nødvendig spekter for å avgjøre hvordan en bestemt gen perturbs hårsekken gjenfødelse sti og hvordan to gener samhandle. Fjerning av kammeret (figur 2A) må gjøres med forsiktighet. Den nydannede pode bør være litt ugjennomsiktig med en kjedelig overflate (figur 2B). Transplantasjonen kan feste seg til kammeret, så forsiktig løfte den ene siden er det viktig å sørge for at pode forblir festet til sårsengen. Transplantatet er ganske stabil etter tre dager, og skal presentere litt problemer når du fjerner bandasjen. Robust hårvekst bør observeres etter tre uker (Figur 2C). Utelate enten mDCs eller KCS vil resultere i et gjenvunnet sårstedet uten hår (figur 2D) 11. Celledød eller celletap i ett avcelletyper resulterer også i uten hår, i motsetning til redusert hår regenerering i dermal-smo knockdown som vist i figur 1b. For å sikre en vellykket assay, er det avgjørende å oppnå mer enn 90% virus-infeksjon av celler med egnet overekspresjon eller knockdown effektivitet før pode. På grunn av tidsbegrensninger i pode prosedyren, anbefaler vi feilsøking virusinfeksjon effektivitet før du starter en pode eksperiment, og alltid lagre en liten del av celler på dagen for pode prosedyre for å verifisere tap-eller gevinst-of-uttrykk. Lentiviral titer vil variere avhengig konstruere brukt og bør bestemmes før infeksjon å oppnå 90-100% effektivitet. Vi overvåker virusinfeksjon effektivitet med GFP coexpressed fra lentiviral vektor. Vi rutinemessig utføre kvantitativ PCR og / eller Western blot for å fastslå omfanget av knockdown eller overekspresjon. Utnytte dual-ekspresjonsvektorer med fluorescerende tagger å merkevirusinfiserte celler gir en måte å rapportere perdurance signal og antall celler som uttrykker våre konstruksjoner i modne grafts. Vi bruker GFP drevet av en CMV promoter fra lentiviral vektor pSicoR-CMV-GFP 10 i kombinasjon med Smo shRNA. I figur 3 viser vi en 3-ukers gamle dermal-spesifikke pode der GFP er lentivirally-uttrykk i dermal papilla av et representativt hårsekken. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figur 1. Histologisk analyse av hårsekken vekst. (A) Se på kontroll hår regenerasjon pode med dermal celler infisert med tom lentiviral vektor og ubehandlede keratinocytter. (B) glattet knockdown hjelp lentiviral shRNA i dermal celler kombinert med ubehandlede keratinocytter resulterer i tap av hårsekker. (C) Hematoxylin og eosin farging viser anagen hår follicles i kontroll grafts går dypere ned i dermis og (D) glattet knockdown hårsekkene forbli forkrøplet og i stor grad fraværende. Alle bilder er tre uker etter pode. Målestokk betegner 100 mikrometer. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figur 2. Pode primære celler. (A) nu / nu mus med suturerte tokammerhus primære dermal celler og keratinocytter. (B) Fjerning av kammeret avdekker nydannede hud som er kjedelig og ugjennomsiktig i karakter. (C) fullvoksen hår på pode med vill- type primær dermal celler og keratinocytter på tre uker etter poding. (D) Tilsetting av primære dermal celler uten keratinocytter fører til ikke hår etter tre uker. Lignende resultater er sett med tilsetning av primære keratinocytter uten dermal celler. Figur 3. Vedlikehold av GFP uttrykk i dermal papilla. Confocal bilder av dermal papilla fra en 3-ukers gamle regenerert pode. GFP ble uttrykt i dermal cellepopulasjon fra en lentiviral vektor og oppdaget i dermal papilla (grønn). Versican (rød) avgrenser dermal papilla og kjerner var etiketten med Hoechst (blå). Obs GFP uttrykkes spesifikt i dermale celler, men ikke i de omkringliggende keratinocytter. Skala bar betegner 20 mikrometer.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration (Video) | JoVE

Vev-spesifikk analyse av en hårsekken regenerering modellen bruker lentivirus å megle gevinst-eller tap av funksjon.

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse (Video) | JoVE

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis (Video) | JoVE

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts (Video) | JoVE

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development (Video) | JoVE

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica (Video) | JoVE

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures (Video) | JoVE

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair (Video) | JoVE

Utvinning og analyse av kortisol fra Menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images (Video) | JoVE

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

Påvisning av alternativ spleising Under epithelial-Mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis (Video) | JoVE

En ny teknikk for Kvantitativ analyse av Håravfall i Mus Bruke gråtoner Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...