Name: dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une bourse Ehrman à HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale postdoctorale bourse de JJR, des subventions du NIH F32EY016309 au format DV, Bourse de Thèse Université de New York doyen de DJ, NIH GrantR01 EY13010 de CD et une bourse de recherche DFG à JR (RI 2208/1- 1). Nous remercions Nina Vogt et Pamela Boodram des commentaires sur le manuscrit.

1. Introduction Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d&#39;autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir 16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l&#39;imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux...

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	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. 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J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. 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1. Dépannage D&#39;après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main 21 par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils. Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs e...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Préparer la solution mère 10x 20. Diluer avec de l&#39;eau distillée pour obtenir PBS 1x et stocker à température ambiante. Laisser refroidir dans la glace avant dissections. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Attention: Irritant Porter des gants. Préparer 50 ml 1xPBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBST). Conservez-la à température ambiante. </td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde à 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Attention: toxique, cancérogène probable pour l&#39;homme Porter des gants. Avant l&#39;étape de fixation, fraîchement préparer une solution à 3,7% dans une hotte en diluant avec du PBS, magasin sur la glace. </td></tr><tr><td> 5% de sérum normal de cheval </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Préparer 5% v / v de dilution dans du PBST. Conservez-la à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Les anticorps primaires et secondaires (p. ex âne anti-mouton Alexa Fluor 488, Donkey anti-lapin Alexa Fluor 555, âne anti-souris Alexa Fluor 647) </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluer Anticorps secondaires 1:800 dans du PBST et conserver à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluer à 1:100 dans une solution d&#39;anticorps secondaire. </td></tr><tr><td> Réactif Slowfade Antifade Or </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> S36936 </td><td> Milieu de montage. Conserver à -20 degrés. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Pour le montage. Préparer 10 ml de dilution à 50% avec de l&#39;eau, magasin distillée à la température ambiante. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Pour anesthésier les mouches adultes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Deux pinces pointues (Dumont # 55) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Préparer plat dissection Sylgard en remplissant un plat de Petri en plastique avec le mélange Sylgard. </td></tr><tr><td> Trois puits plats dissection de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two broches minuties de dissection (0,1 mm de diamètre) et deux pinholders (12 cm) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Insérer une broche de minuties dans chacun des deux pinholders et plier une des repères pour former un crochet. </td></tr><tr><td> Lamelles de microscope (22x22-1 et 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope (25x75x1.0 mm; préalablement nettoyé) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml microtubes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Effacer vernis à ongles ou du scotch </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitateur orbital </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîte de support de diapositives </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pinceau mince </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 et P200 micropipette et de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Petit seau avec de la glace </td><td></td><td></td><td> Pour refroidir les plaques de verre, ainsi disséquées rétine et les solutions. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

L&#39;œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d&#39;environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d&#39;environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 3 4. Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux 5: Dans le sous-type &#39;p&#39;, p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type &#39;y&#39;, y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S 6 7 8. Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque 9 et déclenche l&#39;ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies 10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d&#39;importantes modifications morphologiques 15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d&#39;expression finalement rh. Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines ( <strong&gt; Figure 1).

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

La<em&gt; Drosophila</emRétine&gt; est un réseau cristallin de type composé d&#39;un petit nombre de types de cellules qui sont produites d&#39;une manière stéréotypée<sup&gt; 1</sup&gt;. De la perméabilité à l&#39;analyse génétique sophistiquée permet l&#39;étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l&#39;accent sur la différenciation des photorécepteurs.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

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