Name: dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio a Ehrman HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund per la borsa di studio post-dottorato di ricerca medica RJJ, NIH Grant F32EY016309 a DV, Fellowship Tesi di New York University di Dean a DJ, NIH GrantR01 EY13010 su CD e una borsa di studio per DFG JR (RI 2208/1- 1). Ringraziamo Nina Vogt e Pamela Boodram per i commenti sul manoscritto.

1. Introduzione In questo video, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo: il terzo instar larvali, la midpupal e la fase adulta. Anche se il nostro protocollo funziona anche per le altre fasi di pupa (per i dettagli su fasi precedenti, vedi 16), abbiamo scelto lo stadio midpupal, come è ottimale per l&#39;imaging tutte le PR in un unico piano focale e la loro nuclei sono facilmente identificabili, che facilita la visua...

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	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. 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J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li><li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors.">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li></ol>

1. Risoluzione dei problemi Nella nostra esperienza, dissezioni richiedono una pratica (fino a diverse settimane) e sono facilitate da raggiungere una posizione comoda a mano 21 con appoggio i gomiti e gli avambracci sul tavolo e con le dita in contatto con il piatto dissezione. Dita In questo modo, solo il pollice, indice e medio compiere movimenti sottili. Rimozione della lamina senza danneggiare i fotorecettori è probabilmente il passo più difficile....

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS1x, pH 7.4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Preparare soluzione di 10x 20. Diluire con acqua distillata per ottenere 1x PBS e conservare a temperatura ambiente. Raffreddare in ghiaccio prima dissezioni. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Attenzione: Irritante Indossare guanti. Preparare 50 ml 1xPBS con 0,3% Triton X-100 (PBST). Conservare a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> Soluzione di formaldeide al 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Attenzione: Tossico, probabile cancerogeno umano Indossare guanti. Prima della fase di fissazione, di fresco preparare 3,7% soluzione in una cappa di diluizione con PBS, negozio su ghiaccio. </td></tr><tr><td> 5% di siero di cavallo normale </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Preparare 5% v / v di diluizione in PBST. Conservare a quattro gradi. </td></tr><tr><td> Gli anticorpi primari e secondari (ad esempio, Donkey anti-pecore Alexa Fluor 488, Donkey-coniglio anti Alexa Fluor 555, Donkey anti-topo Alexa Fluor 647) </td><td> Probes Invitrogen Molecular </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluire 1:800 anticorpi secondari in PBST e conservare a quattro gradi. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 falloidina </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluire 1:100 in soluzione anticorpo secondario. </td></tr><tr><td> Slowfade Oro Antifade reagente </td><td> Probes Invitrogen Molecular </td><td> S36936 </td><td> Mezzo di montaggio. Conservare a -20 gradi. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Per il montaggio. Preparare 10 ml di 50% di diluizione con acqua distillata, conservare a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Per anestetizzare mosche adulte. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Due pinze taglienti (Dumont # 55) </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit di silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Preparare piatto dissezione Sylgard compilando un piatto di plastica con la miscela Sylgard Petri. </td></tr><tr><td> Tre piatti e vetro dissezione </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two perni minutien dissezione (0,1 mm di diametro) e due pinholders (12 cm) </td><td> Strumenti per le scienze Belle </td><td> 26002-10 </td><td> Inserire un pin minutien in ciascuno dei due pinholders e piegare uno dei perni per formare un gancio. </td></tr><tr><td> Microscopio vetrini coprioggetto (22x22-24x40-1 e 1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini portaoggetto (25x75x1.0 mm; predepurata) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microcentrifuga tubi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cancellare smalto o nastro adesivo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitatore orbitale </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Far scorrere il porta finestra </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pennello sottile </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 e P200 micropipette e suggerimenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Piccolo secchio con ghiaccio </td><td></td><td></td><td> Per raffreddare le lastre di vetro e, retine sezionati e soluzioni. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

L&#39;occhio composto di Drosophila melanogaster è composto da circa 750 ommatidi (occhi unità). Ogni ommatidium è composto da circa 20 cellule, inclusa la lente-secernenti coni, cellule del pigmento, una cella a setole e otto fotorecettori (PR) R1-R8 2. Il PRS hanno le strutture di microvillar, le rhabdomeres, che contengono pigmenti sensibili alla luce, i rodopsine (sd). Le rhabdomeres di sei PR (R1-R6) formano un trapezio e contengono Th1 3 4. Le rhabdomeres di R7 e R8 sono posizionati in tandem nel centro del trapezio e condividono lo stesso percorso della luce. R7 e R8 PR stocasticamente esprimono diverse combinazioni di Rhs in due sottotipi principali 5: Nel sottotipo la &#39;p&#39;, in p RH3 R7s è accoppiato con RH5 in p R8s, mentre nel sottotipo del &#39;y&#39;, Rh4 in y R7s è associato RH6 in y R8S 6 7 8. Prime caratteristiche di PR e sviluppo di ommatidi inizia nella larvale eye-antennali disco immaginale, un monostrato di cellule epiteliali. Un&#39;ondata di differenziazione spazza tutto il disco 9 e avvia l&#39;assemblaggio di cellule indifferenziate in ommatidi 10-11. La R8 &#39;cella fondatore&#39; è specificato prima e recluta R1-6 e poi R7 12-14. Successivamente, durante lo sviluppo pupale, PR differenziazione porta a vasti cambiamenti morfologici 15, tra cui la formazione di rhabdomere, sinaptogenesi e di espressione alla fine rh. In questo protocollo, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo della retina, che possono essere applicati per affrontare una serie di questioni concernenti la formazione della retina e percorsi di sviluppo. Qui, usiamo questi metodi per visualizzare la differenziazione graduale PR a livello di singola cellula per intero monte larvale, midpupal e adulti retine ( <sTrong&gt; Figura 1).

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Il<em&gt; Drosophila</emRetina&gt; è un reticolo cristallino composto da un piccolo numero di tipi cellulari che sono generati in modo stereotipato<sup&gt; 1</sup&gt;. La sua riconducibilità a sofisticate analisi genetica permette lo studio di complessi programmi di sviluppo. Questo protocollo descrive le dissezioni e immunoistochimica di retina in tre distinte fasi di sviluppo, con particolare attenzione alla differenziazione dei fotorecettori.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

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