Name: dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Ehrman para HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para a comunhão de Pesquisa Médica de pós-doutorado para RJJ, NIH Grant F32EY016309 para DV, bolsa de Nova York University Dean Dissertação de DJ, NIH GrantR01 EY13010 em CD e uma bolsa DFG a JR (RI 2208/1- 1). Agradecemos Nina Vogt e Pamela Boodram para comentários sobre o manuscrito.

1. Introdução Neste vídeo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos de desenvolvimento definidos: o terceiro ínstar, o midpupal ea fase adulta. Embora nosso protocolo também funciona para outras fases de pupa (para mais detalhes sobre etapas anteriores, consulte 16), que escolheu o palco midpupal, pois é ideal para imagens de todos os PRs em um plano focal e seus núcleos são facilmente identificáveis, o que facilita a visualiza...

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1. Solução de problemas Em nossa experiência, dissecções requerem prática (várias semanas) e são facilitados por alcançar uma posição confortável da mão 21 por descansar os cotovelos e antebraços sobre a mesa e com os dedos fazendo contato com o prato dissecção. Dedos Dessa forma, apenas os polegares o índice e meio realizar movimentos sutis. Remover a lâmina sem danificar os fotorreceptores é provavelmente o passo mais desafiador. Prá...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Preparar a solução estoque 10x 20. Dilui-se com água destilada para se obter 1 x PBS e armazenamento à temperatura ambiente. Esfriar em gelo antes de dissecações. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Cuidado: Irritante Usar luvas. Preparar 50 ml de 1xPBS com 0,3% de Triton X-100 (PBST). Armazenar à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> Solução de formaldeído a 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Cuidado: Tóxico, provável carcinógeno humano Usar luvas. Antes do passo de fixação, de fresco preparar uma solução 3,7% em uma capa química fumos por diluição com PBS, armazenar em gelo. </td></tr><tr><td> Soro de cavalo 5% normal </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Prepare a 5% de diluição em v / v em PBST. Armazenar em quatro graus. </td></tr><tr><td> Anticorpos primários e secundários (por exemplo, Donkey anti-carneiro Alexa Fluor 488, Donkey anti-coelho Alexa Fluor 555, Donkey anti-rato Alexa Fluor 647) </td><td> Sondas Invitrogen Molecular </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluir anticorpos secundários 1:800 em PBST e armazenar a quatro graus. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Faloidina </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluir 1:100 em solução de anticorpo secundário. </td></tr><tr><td> Slowfade reagente Antifade Ouro </td><td> Sondas Invitrogen Molecular </td><td> S36936 </td><td> Meio de montagem. Armazenar a -20 graus. </td></tr><tr><td> Glicemiarol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Para a montagem. Preparar 10 ml de diluição de 50% com água destilada armazenamento, à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Para anestesiar moscas adultas. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Duas pinças afiadas (Dumont # 55) </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Prepare Sylgard prato dissecção preenchendo uma placa de Petri de plástico com mistura Sylgard. </td></tr><tr><td> Três poços de dissecção pratos de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> TwO pins minutien dissecando (0,1 mm de diâmetro) e dois pinholders (12 cm) </td><td> Belas ferramentas de Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Inserir um pino minutien em cada um dos dois pinholders e dobrar um dos pinos para formar um gancho. </td></tr><tr><td> Microscópio lamínulas (22x22-1 e 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscópio (25x75x1.0 mm; previamente limpas) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga 1,5 ml tubos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Limpar unha polonês ou fita adesiva </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital </td><td> Bélico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caixa de suporte de slides </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pincel fino </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 e P200 micropipetas e dicas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pequeno balde com gelo </td><td></td><td></td><td> Para o arrefecimento das placas de vidro assim, retinas dissecadas e soluções. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

O olho composto de Drosophila melanogaster é composto por cerca de 750 omatídeos (olhos de unidades). Cada omatídeo é composto de cerca de 20 células, incluindo as células secretoras de lente de cone, as células de pigmento, uma célula de cerdas e oito fotorreceptores (RP) R1-R8 2. A RP têm estruturas especializadas microvilares, os rhabdomeres, que contêm pigmentos sensíveis à luz, os rodopsinas (RHS). Os rhabdomeres de seis PRs (R1-R6) formar um trapézio e conter Rh1 3 4. Os rhabdomeres de R7 e R8 são posicionadas em conjunto no centro do trapézio e partilhar o mesmo caminho de luz. R7 e R8 PRs estocasticamente expressar diferentes combinações de RHS em dois principais subtipos 5: Em subtipo &#39;p&#39;, RH3 em p R7s é acoplado com RH5 em p R8s, enquanto no subtipo do &#39;y&#39;, RH4 em y R7s está associada RH6 em y R8s 6 7 8. As primeiras especificações de RP e desenvolvimento de omatídeos começa no disco de olhos antenal larval imaginal, uma monocamada de células epiteliais. Uma onda de diferenciação varre o disco 9 e inicia a montagem de células indiferenciadas em omatídeos 10-11. R8 a &quot;célula fundador &#39;é especificada primeiro e recruta R1-6 e depois R7 12-14. Posteriormente, durante o desenvolvimento pupal, diferenciação PR leva a grandes mudanças morfológicas 15, incluindo a formação rhabdomere, sinaptogênese e expressão eventualmente rh. Neste protocolo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos definidos de desenvolvimento da retina, o que pode ser aplicada para resolver uma variedade de questões relativas à formação da retina e vias de desenvolvimento. Aqui, usamos esses métodos para visualizar a diferenciação PR gradual no nível de uma única célula em toda montagem larval, midpupal e retinas adulto ( <sTrong&gt; Figura 1).

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

O<em&gt; Drosophila</emRetina&gt; é uma estrutura cristalina do tipo composto por um pequeno número de tipos de células que são geradas de um modo estereotipado<sup&gt; 1</sup&gt;. Sua receptividade à análise genética sofisticada permite o estudo de complexos programas de desenvolvimento. Este protocolo descreve dissecações e imunohistoquímica de retinas em três distintas fases de desenvolvimento, com foco na diferenciação de fotorreceptores.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Research

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Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

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The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

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Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

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Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

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Aquisição de Vídeo de Alta Qualidade Digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvais e adultas Comportamentos de uma perspectiva lateral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

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The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

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Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

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Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...