Name: dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una beca de Ehrman a HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para la beca de investigación postdoctoral médica a JJR, NIH subvención F32EY016309 a DV, una Beca Universidad de Nueva York Dean Disertación para DJ, NIH EY13010 GrantR01 para CD y una beca de la DFG a JR (RI 2208/1- 1). Damos las gracias a Nina Vogt y Boodram Pamela para comentarios sobre el manuscrito.

1. Introducción En este vídeo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo: larvas del tercer instar, midpupal y la etapa adulta. Aunque nuestro protocolo también funciona para otros pupa (para más detalles sobre las etapas anteriores, véase 16), se optó por el escenario midpupal, ya que es óptima para todos los RP imágenes en un plano focal y sus núcleos son fácilmente identificables, lo que facilita ...

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1. Solución de problemas En nuestra experiencia, las disecciones requieren práctica (hasta varias semanas) y son facilitados por lograr una posición cómoda de la mano 21 descansando los codos y los antebrazos sobre la mesa y con los dedos en contacto con la placa de disección. De esta forma los dedos, los pulgares sólo el, índice y medio realizar movimientos sutiles. Extracción de la lámina sin dañar los fotorreceptores es probablemente el paso ...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Preparar una solución madre 10x 20. Diluir con agua destilada hasta obtener 1 x PBS y se almacena a temperatura ambiente. Enfriar en hielo antes de disecciones. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Precaución: Irritante Utilice guantes. Preparar 50 ml de 1xPBS con 0,3% Triton X-100 (PBST). Almacenar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> 37% solución de formaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Precaución: carcinógeno tóxico, humano probable Utilice guantes. Antes de la etapa de fijación, recién preparar 3,7% de solución en una campana química diluyendo con PBS, tienda en el hielo. </td></tr><tr><td> 5% de suero normal de caballo </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Preparar 5% v / v en PBST dilución. Tienda a cuatro grados. </td></tr><tr><td> Anticuerpos primarios y secundarios (por ejemplo, burro anti-oveja Alexa Fluor 488, burro anti-conejo Alexa Fluor 555, de burro anti-ratón Alexa Fluor 647) </td><td> Invitrogen Molecular Probes </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluir secundaria de anticuerpos 1:800 en PBST y se almacena a cuatro grados. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 faloidina </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluir 1:100 en solución de anticuerpo secundario. </td></tr><tr><td> Slowfade Oro reactivo Antifade </td><td> Invitrogen Molecular Probes </td><td> S36936 </td><td> Medio de montaje. Almacenar a -20 grados. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Para el montaje. Preparar 10 ml de 50% de dilución con agua destilada tienda, a la temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Para anestesiar a las moscas adultas. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Dos pinzas cortantes (Dumont # 55) </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Elastómero de silicona Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Preparar plato Sylgard disección llenando una placa Petri de plástico con la mezcla de Sylgard. </td></tr><tr><td> Tres pocillos de vidrio de disección </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two minutien disección pins (0,1 mm de diámetro) y dos pinholders (12 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26002-10 </td><td> Insertar un pasador minutien en cada uno de los dos pinholders y doblar uno de los pasadores para formar un gancho. </td></tr><tr><td> Microscopio desliza la tapa (22x22-1 y 1-24X40) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos (25x75x1.0 mm; limpieza previa) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microcentrífuga </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esmalte de uñas transparente o cinta adhesiva </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitador orbital </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slide cuadro titular </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pincel fino </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 y P200 Micropipetas y puntas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pequeño cubo con hielo </td><td></td><td></td><td> Para el enfriamiento de las placas de vidrio, la retina disecados y soluciones. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster se compone de alrededor de 750 omatidios (ojos unitarios). Cada ommatidium se compone de alrededor de 20 células, incluyendo las células secretoras de cono-lente, células de pigmento, una célula de cerdas y ocho fotorreceptores (RP) R1-R8 2. Los BPs tienen estructuras especializadas microvillar, los rhabdomeres, que contienen pigmentos sensibles a la luz, la rodopsina (RHS). Los rhabdomeres de seis rupias (R1-R6) forman un trapecio y contienen Rh1 3 4. Los rhabdomeres de R7 y R8 están situados en tándem en el centro del trapezoide y comparte el mismo camino de la luz. R7 y R8 RP estocásticamente expresan diferentes combinaciones de RHS en dos subtipos principales 5: En el subtipo &#39;p&#39;, p RH3 en R7s se acopla con Th5 en p R8s, mientras que en el subtipo &#39;y&#39;, Th4 en R7s y se asocia con RH6 en y r8s 6 7 8. Especificación temprana de RP y desarrollo de omatidios comienza en el ojo larval-antenal disco imaginal, una monocapa de células epiteliales. Una ola de diferenciación barre a través del disco 9 e inicia el ensamblaje de células indiferenciadas en ommatidia 10-11. El R8 &#39;célula fundador se especifica primero y recluta R1-6 y R7 12-14. Posteriormente, durante el desarrollo pupal, PR diferenciación conduce a amplios cambios morfológicos 15, incluyendo la formación de rhabdomere, sinaptogénesis y la expresión final rh. En este protocolo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo de la retina, que se pueden aplicar para abordar una variedad de cuestiones relativas a la formación de la retina y las vías de desarrollo. Aquí, nosotros usamos estos métodos para visualizar la gradual diferenciación PR a nivel de una sola célula en su totalidad larval monte, midpupal retinas y adultos ( <strong&gt; Figura 1).

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

La<em&gt; Drosophila</emRetina&gt; es una red cristalina de tipo compuesto por un pequeño número de tipos de células que se generan de una manera estereotipada<sup&gt; 1</sup&gt;. Su docilidad al análisis genético sofisticado permite el estudio de complejos programas de desarrollo. Este protocolo describe disecciones e inmunohistoquímica de retinas en tres etapas de desarrollo discretos, con un enfoque en la diferenciación de los fotorreceptores.

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Research

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