Name: laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle at JoVE.com

Wij danken Bob Nowak (Andor Technology) voor technische hulp en advies. SA-S. wordt ondersteund door een Heisenberg fellowship van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG subsidie ​​SE2016/7-1.

1. Labeling Losse Cellen Injecteer eencellige embryo&#39;s met een plasmide dat codeert voor GFP of GFP-fusie-eiwit onder controle van een β-actine promoter. Tijdens de ontwikkeling wordt GFP vervolgens uitgedrukt in een mozaïek mode. Hier gebruikten wij het ​​transgene construct Tg [β-actine: α-actinine-GFP], welke plaatsen de α-actinine-GFP fusie-eiwit onder controle van de β-actine promoter. 2. Embryo Embedding <ol class="lalpha"><l...

<ol>
	<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration.">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).</li><li>Steffen, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+runzel+muscular+dystrophy+is+linked+to+the+titin+gene.">The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene.</a> Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).</li><li>Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+mutants+to+identify+secondary+target+effects+of+acetylcholine+esterase+inhibitors.">The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors.</a> Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+proteins+mark+injured+skeletal+muscle+in+zebrafish.">Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish.</a> PLoS One. 7, e31041 (2012).</li><li>Roostalu, U., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+somite+cell+rearrangements+lead+to+distinct+waves+of+myotome+growth.">Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth.</a> Development. 134, 1253-1257 (2007).</li><li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).</li><li>Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+dedifferentiation+provides+replacement+tissue+during+zebrafish+fin+regeneration.">Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li></ol>

Laser-gemedieerde schade is een krachtige methode voor het toebrengen van wonden van een gewenste grootte door ablatie cellen om regeneratie te bestuderen onder gecontroleerde omstandigheden in de zebravis embryo. Met name kunnen cellen nauwkeurig worden gericht (figuur 2) en de schade-gebied en timing worden geregeld. Vervolgens worden de verwonding en regeneratieprocessen gemakkelijk gevolgd, opgenomen (figuur 3) en geanalyseerd (Figuur 1). Hoewel de laser goed gerich...

<table border="1"><tbody><tr><td> Verwarmingsblok </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paar # 5 pincet </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glasplaten </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm # 1 </td></tr><tr><td> Vaseline </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscoop </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint laser </td><td> Andor Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentia <ul><li> Laag-smeltpunt agarose (# 50081Lonza) </li><li> Tricaine voorraadoplossing: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O pH 9,0 </li><li> E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle

Verschillende experimentele benaderingen zijn gebruikt in de muis om spierblessure veroorzaken, met als doel om spieren regeneratie te bestuderen, met inbegrip van myotoxin injecties (bupivacaïne, cardiotoxine of notexin), spier transplantaties (denervatie-devascularization geïnduceerde regeneratie), intensieve lichaamsbeweging, maar ook muizen spierdystrofie modellen zoals de mdx muis (voor een overzicht van deze benaderingen zie 1). In zebravis, genetische benaderingen zijn mutanten die spierdystrofie fenotypen (zoals runzel 2 of sapje 3) vertonen en antisense oligonucleotide morfolino dat de expressie van dystrofie-geassocieerde genen 4 blokkeren. Bovendien chemische benaderingen mogelijk, bijv. met Galanthamine, een chemische verbinding remmen acetylcholinesterase, hetgeen resulteert in hypercontraction, wat uiteindelijk leidt tot spierdystrofie 5. Echter, genetische en farmacologische benaderingen generally van invloed op alle spieren binnen een individu, terwijl de omvang van fysiek toegebracht letsel gemakkelijker in ruimte en tijd 1 gecontroleerd. Gelokaliseerde lichamelijk letsel kan de beoordeling van de contralaterale spier als een interne controle. Inderdaad hebben we onlangs gebruikte laser gemedieerde ablatie naar skeletspier regeneratie te bestuderen in de zebravis embryo 6, terwijl een andere groep onlangs gemeld het gebruik van een twee-foton laser (822 nm) zeer lokaal beschadigd plasmamembraan van embryoethische zebravis spier cellen 7. Hier rapporteren we een methode voor het gebruik van de Micropoint laser (Andor Technology) zorgt voor skeletspieren celschade in de zebravis embryo. De Micropoint laser is een hoge energie laser die geschikt is voor doelwitcel ablatie bij een golflengte van 435 nm. De laser is verbonden met een microscoop (in onze setup, een optische microscoop van Zeiss) zodanig dat de microscoop worden tegelijkertijd fof scherpstellen het laserlicht op het monster en visualiseren van de effecten van de verwonding (helderveld of fluorescentie). De parameters voor het regelen van laserpulsen omvatten golflengte, intensiteit en aantal pulsen. Door de transparantie en externe embryonale ontwikkeling, het zebravis embryo zeer vatbaar voor zowel laser geïnduceerde schade en voor het bestuderen van het daaropvolgende herstel. Tussen 1 en 2 dagen na de bevruchting, somitic skeletspiercellen geleidelijk ondergaan rijping van anterior naar vanwege de progressie van somitogenesis posterior van de stam naar staart 8, 9. Op deze stadia, embryo spontaan trillen en initiëren zwemmen. De zebravis is onlangs erkend als een belangrijk vertebrate modelorganisme voor de studie van weefselregeneratie, met vele soorten weefsels (hart, neuronale, vasculaire etc.) kunnen worden geregenereerd na letsel in de volwassen zebravis 10, 11.

Laser-gemedieerde schade werd uitgevoerd op geïmmobiliseerde 1 dag-oude embryo&#39;s. Zoals getoond in figuur 1 kan een enkele laser pulsen genereren een kleine wond, herkenbaar aan de beschadigde, opgerold Actin-rijke myofibrillen die normaal gespannen tussen de somiet grenzen. Een groter aantal laserpulsen zal echter leiden tot een massief blok beschadigd somiet, waar de meeste myofibrillen worden vernietigd. Toch kunnen we letterlijk zien dat &quot;tijd alle wonden heelt&quot;, met kleine blessures ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle at JoVE.com

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo&#39;s met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...