Name: laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00
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Ringraziamo Bob Nowak (Andor Technology) per assistenza e consulenza tecnica. SA-S. è sostenuto da una borsa di studio Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto da DFG concessione SE2016/7-1.

1. Etichettatura singole cellule Iniettare unicellulari embrioni allo stadio con un plasmide codificante GFP o qualsiasi proteina di fusione GFP sotto il controllo di un promotore di β-actina. Durante lo sviluppo, GFP è quindi espresso in modo mosaico. Qui, abbiamo usato il costrutto transgenico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], che pone l&#39;α-actinina-proteina di fusione GFP sotto il controllo del promotore di β-actina. 2. Embrione Embedding <...

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	<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration.">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).</li><li>Steffen, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+runzel+muscular+dystrophy+is+linked+to+the+titin+gene.">The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene.</a> Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).</li><li>Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+mutants+to+identify+secondary+target+effects+of+acetylcholine+esterase+inhibitors.">The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors.</a> Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+proteins+mark+injured+skeletal+muscle+in+zebrafish.">Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish.</a> PLoS One. 7, e31041 (2012).</li><li>Roostalu, U., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+somite+cell+rearrangements+lead+to+distinct+waves+of+myotome+growth.">Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth.</a> Development. 134, 1253-1257 (2007).</li><li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).</li><li>Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+dedifferentiation+provides+replacement+tissue+during+zebrafish+fin+regeneration.">Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li></ol>

Laser-mediata lesione è un metodo efficace per infliggere ferite della dimensione desiderata da ablazione cellule per studiare la rigenerazione in condizioni controllate in zebrafish. In particolare, le cellule possono essere mirati proprio (Figura 2) e sia l&#39;area ferita e tempi può essere controllato. Successivamente, il sito di lesione e processi di rigenerazione sono facilmente controllati, registrati (Figura 3) e analizzati (Figura 1). Tuttavia, anche se il la...

<table border="1"><tbody><tr><td> Riscaldamento del blocco </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coppia pinze # 5 </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diapositiva su vetro </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm N ° 1 </td></tr><tr><td> Vaselina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint laser </td><td> Andor Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti <ul><li> Basso punto di fusione agarosio (# 50081,Lonza) </li><li> Tricaine Soluzione madre: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml di dH 2 O pH 9,0 </li><li> Media E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle

Diversi approcci sperimentali sono stati utilizzati nel topo per indurre infortunio muscolare, con l&#39;obiettivo di studiare la rigenerazione muscolare, compresi gli apporti myotoxin (bupivacaina, cardiotossina o notexin), trapianti muscolari (denervazione-devascolarizzazione rigenerazione indotta), esercizio fisico intenso, ma anche modelli murini distrofia muscolare come ad esempio il topo mdx (per una rassegna di questi approcci vedi 1). In zebrafish, approcci genetici includono mutanti che presentano fenotipi distrofia muscolare (come runzel 2 o sapje 3) e antisenso Morpholinos oligonucleotide che bloccano l&#39;espressione di geni associati alla distrofia 4. Inoltre, approcci chimici sono possibili, per esempio con Galanthamine, un composto chimico inibente acetilcolinesterasi, ottenendo in tal modo ipercontrazione, che finisce per distrofia muscolare 5. Approcci tuttavia, genetici e farmacologici generally colpire tutti i muscoli all&#39;interno di un individuo, mentre l&#39;entità delle ferite inferte fisicamente sono più facilmente controllabili spazialmente e temporalmente 1. Localizzata lesioni consente la valutazione del muscolo controlaterale come controllo interno. Infatti, abbiamo recentemente utilizzato ablazione laser-mediata delle cellule per studiare la rigenerazione del muscolo scheletrico nel zebrafish 6, mentre un altro gruppo ha recentemente riportato l&#39;uso di un laser a due fotoni (822 nm) per danneggiare molto localmente la membrana plasmatica di singoli muscoli zebrafish embrionale celle 7. Qui, si riporta un metodo per utilizzare il laser Micropoint (Andor Technology) per lesioni cellula muscolare scheletrica in zebrafish. Il laser Micropoint è un laser ad alta energia che è adatto per l&#39;ablazione cellula bersaglio alla lunghezza d&#39;onda di 435 nm. Il laser viene collegato ad un microscopio (nel nostro setup, un microscopio ottico Zeiss da) in modo tale che il microscopio può essere utilizzato al tempo stesso fo focalizzare la luce laser sul campione e per visualizzare gli effetti della ferita (campo chiaro o fluorescenza). I parametri per controllare gli impulsi laser comprendono lunghezza d&#39;onda, intensità e numero di impulsi. Grazie alla sua trasparenza ed esterna sviluppo embrionale, l&#39;embrione di zebrafish è altamente suscettibile sia indotta da laser pregiudizio e per lo studio del successivo recupero. Tra 1 e 2 giorni dopo la fecondazione, somitic cellule muscolari scheletriche progressivamente maturano da anteriore a posteriore a causa della progressione della somitogenesis dal tronco alla coda 8, 9. In queste fasi, embrioni spontaneamente twitch e avviare il nuoto. Il pesce zebra è stata recentemente riconosciuta come un importante organismo modello vertebrato per lo studio della rigenerazione dei tessuti, come molti tipi di tessuti (cardiache, neuronale, vascolare ecc) possono essere rigenerati dopo lesione nell&#39;adulto zebrafish 10, 11.

Lesioni laser-mediata è stata eseguita su immobilizzati 1 giorno di età embrioni. Come mostrato in figura 1, un paio di impulsi laser può generare una ferita piccola, facilmente riconoscibili dai danneggiati, arrotolati, Actina ricchi miofibrille che sono normalmente tese tra i confini somite. Un più alto numero di impulsi laser sarà comunque comportare un blocco somite massicciamente danneggiato, dove vengono distrutti maggior miofibrille. Tuttavia, si può osservare che letteralmente &quot;il tem...

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Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

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