Name: laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00
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Damos las gracias a Bob Nowak (Andor Technology) para la ayuda técnica y asesoramiento. SA-S. con el apoyo de una beca Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue apoyado por la DFG subvención SE2016/7-1.

1. Etiquetado de células individuales Inyectar una célula de embriones etapa con un plásmido que codifica GFP o cualquier proteína GFP-fusión bajo el control de un promotor de β-actina. Durante el desarrollo, la GFP se expresa entonces en forma de mosaicos. Aquí, se utilizó el constructo transgénico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], que coloca la proteína de fusión α-actinina-GFP bajo el control del promotor de la β-actina. 2. Embriones ...

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Laser lesión mediada es un método poderoso para infligir heridas de un tamaño deseado mediante la ablación de las células con el fin de estudiar la regeneración bajo condiciones controladas en el embrión de pez cebra. En particular, las células pueden ser dirigidos con precisión (Figura 2) y tanto el área de la lesión así como de temporización puede ser controlada. Posteriormente, el sitio de la lesión y los procesos de regeneración son fácilmente controlados, registrados (Figura...

<table border="1"><tbody><tr><td> Calefacción bloque </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Par N º 5 fórceps </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm # 1 </td></tr><tr><td> Jalea de petróleo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint láser </td><td> Andor Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> El software Metamorph </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos <ul><li> Bajo punto de fusión de agarosa (# 50081,Lonza) </li><li> Tricaína solución madre: 400 mg tricaína (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O pH 9,0 </li><li> Medio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle

Varios enfoques experimentales se han utilizado en ratón para inducir lesión muscular con el objetivo de estudiar la regeneración muscular, incluyendo inyecciones myotoxin (bupivacaína, cardiotoxina o notexin), trasplantes musculares (denervación-desvascularización regeneración inducida), el ejercicio intenso, sino también modelos murinos de distrofia muscular como el ratón mdx (para una revisión de estos enfoques ver 1). En el pez cebra, los enfoques genéticos incluyen mutantes que exhiben fenotipos de distrofia muscular (como runzel 2 o sapje 3) y antisentido morfolinos de oligonucleótidos que bloquean la expresión de genes asociados a la distrofia 4. Además, los enfoques químicos también son posibles, por ejemplo, con la galantamina, un compuesto químico inhibiendo la acetilcolinesterasa, resultando así en hipercontracción, que finalmente conduce a la distrofia muscular 5. Sin embargo, los enfoques genéticos y farmacológicos generalmente afectar a todos los músculos dentro de un individuo, mientras que la extensión de las lesiones infligidas físicamente son más fácilmente controlados espacial y temporalmente 1. Lesión física localizada permite la evaluación de músculo contralateral como control interno. De hecho, recientemente hemos utilizado láser mediada por ablación celular para estudiar la regeneración del músculo esquelético en el embrión de pez cebra 6, mientras que otro grupo informó recientemente el uso de un láser de dos fotones (822 nm) a dañar muy localmente la membrana plasmática de músculo individual embrionario de pez cebra células 7. Aquí, se presenta un método para utilizar el láser micropoint (Andor Technology) para lesión celular del músculo esquelético en el embrión de pez cebra. El láser micropoint es un láser de alta energía, que es adecuado para la ablación de células reconocidas en una longitud de onda de 435 nm. El láser está conectado a un microscopio (en nuestra configuración, un microscopio óptico de Zeiss) de tal manera que el microscopio se puede utilizar en el mismo tiempo fo enfocar la luz láser sobre la muestra y para la visualización de los efectos de la herida (campo claro o fluorescencia). Los parámetros para el control de pulsos de láser incluyen longitud de onda, intensidad, y número de pulsos. Debido a su transparencia y el desarrollo embrionario externo, el embrión de pez cebra es altamente susceptible, tanto para la lesión inducida por láser y para el estudio de la recuperación posterior. Entre 1 y 2 días después de la fecundación, las células del músculo esquelético somitic someterse a la maduración progresiva de anterior a posterior debido a la progresión de somitogenesis desde el tronco hasta la cola 8, 9. En estas etapas, los embriones espontáneamente crispar e iniciar la natación. El pez cebra se ha reconocido recientemente como un organismo vertebrado importante modelo para el estudio de la regeneración de los tejidos, como muchos tipos de tejidos (cardiacas, neuronal, vascular, etc) se puede regenerar después de la lesión en el adulto pez cebra 10, 11.

Laser lesión mediada se realizó en inmovilizadas 1 día de edad embriones. Como se muestra en la Figura 1, un láser de pulsos pocos puede generar una pequeña herida, fácilmente reconocible por los dañados, enrollados, actina ricos en miofibrillas que normalmente se extendía entre los límites somite. Un mayor número de pulsos de láser sin embargo resultará en un bloque de somite dañado masivamente, en donde la mayoría de las miofibrillas son destruidos. No obstante, se puede observar que, li...

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Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Investigación

Biología

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...