Name: laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi tackar Bob Nowak (Andor Technology) för teknisk hjälp och råd. SA-S. stöds av en Heisenberg gemenskap av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Detta arbete stöddes av DFG bidrag SE2016/7-1.

1. Märkning enskilda celler Injicera en-cellstadiet embryon med en plasmid som kodar GFP eller någon GFP-fusionsprotein under kontroll av en β-aktin-promotorn. Under utvecklingen, är GFP uttrycks sedan i en mosaik sätt. Här har vi använt den transgena konstruktionen Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP], vilket placerar α-aktinin-GFP fusionsprotein under kontroll av β-aktinpromotorn. 2. Embryo Inbäddning <ol class="lalpha"><li> Samla zebrafisk...

<ol>
	<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration.">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).</li><li>Steffen, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+runzel+muscular+dystrophy+is+linked+to+the+titin+gene.">The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene.</a> Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).</li><li>Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+mutants+to+identify+secondary+target+effects+of+acetylcholine+esterase+inhibitors.">The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors.</a> Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+proteins+mark+injured+skeletal+muscle+in+zebrafish.">Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish.</a> PLoS One. 7, e31041 (2012).</li><li>Roostalu, U., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+somite+cell+rearrangements+lead+to+distinct+waves+of+myotome+growth.">Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth.</a> Development. 134, 1253-1257 (2007).</li><li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).</li><li>Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+dedifferentiation+provides+replacement+tissue+during+zebrafish+fin+regeneration.">Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li></ol>

Laser-medierad skada är en kraftfull metod för att tillfoga sår av en önskad storlek genom ablation celler för att studera regenerering under kontrollerade förhållanden i zebrafisk embryot. Noterbart kan celler riktas exakt (figur 2) och både skadan området samt timing kan styras. Därefter skadan webbplats och för att återhämta sig lätt övervakas, registreras (Figur 3) och analyserades (figur 1). Även lasern fokuserade i x-och y-axeln, är det inte helt ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Värmeblock </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Par # 5 pincett </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glasskivor </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm # 1 </td></tr><tr><td> Vaselin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint laser </td><td> Andor Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> Metamorph programvara </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens <ul><li> Låg smältpunkt agaros (# 50081,Lonza) </li><li> Tricaine stamlösning: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O pH 9,0 </li><li> E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaClz 2, 0,33 mM MgSO 4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle

Olika experimentella metoder har använts i musen för att framkalla muskelskada i syfte att studera muskler förnyelse, inklusive myotoxin injektioner (bupivakain, cardiotoxin eller notexin), transplantationer muskler (denervering-devascularization inducerad regenerering), intensiv träning, men också murina muskeldystrofi modeller såsom MDX musen (för en genomgång av dessa metoder se 1). I zebrafisk, genetiska tillvägagångssätt inkluderar mutanter som uppvisar muskeldystrofi fenotyper (t.ex. runzel 2 eller sapje 3) och antisens oligonukleotid morpholinos som blockerar uttrycket av dystrofi-associerade gener 4. Dessutom, kemiska metoder är också möjliga, t ex med Galantamin, en kemisk förening som inhiberar acetylkolinesteras, vilket resulterar i hypercontraction, vilket slutligen leder till muskeldystrofi 5. Men genetiska och farmakologiska metoder generally påverkar alla muskler i en individ, medan omfattningen av fysiskt förorsakat skador lättare att kontrollera rumsligt och tidsmässigt 1. Lokaliserad fysiska skador möjligt att bedöma om kontralaterala muskeln som en intern kontroll. Faktiskt använde vi nyligen laser-medierad cell-ablation för att studera skelettmuskulaturen regenerering i zebrafisk embryot 6, medan en annan grupp nyligen rapporterat användningen av en två-foton laser (822 nm) för att skada mycket lokalt plasmamembranet enskilda embryonala zebrafisk muskel celler 7. Här rapporterar vi ett förfarande för användning av micropoint lasern (Andor Technology) för skelettmuskulatur cellskada i zebrafisk embryot. Den micropoint laser är en hög energi laser som är lämplig för målsökt cell ablation vid en våglängd av 435 nm. Lasern är ansluten till ett mikroskop (i vår inställning, ett optiskt mikroskop från Zeiss) på ett sådant sätt att mikroskopet kan användas samtidigt feller fokusera laserljuset mot provet och för att visualisera effekterna av sårskada (ljusfält eller fluorescens). Parametrarna för styrning laserpulser inkluderar våglängd, intensitet och antalet pulser. På grund av dess öppenhet och extern embryonal utveckling är zebrafisk embryot mycket mottaglig för både laser-inducerad skada och för att studera den efterföljande återhämtningen. Mellan 1 och 2 dagar efter gödsling, somitic skelettmuskelceller genomgår successivt mognad från främre till posterior grund av utvecklingen av somitogenesis från stammen till svansen 8, 9. Vid dessa stadier, embryon rycka spontant och initiera simning. Zebrafisk har nyligen erkänts som en viktig ryggradsdjur modellorganism för att studera vävnadsregenerering, eftersom många typer av vävnader (hjärt-, neuronal, vaskulär etc.) kan regenereras efter skada i den vuxna zebrafisk 10, 11.

Laser-medierad skada utfördes på immobiliserade 1 dagar gamla embryon. Såsom visas i figur 1, kan ett par laserpulser genererar ett litet sår, lätt identifieras av de skadade, lindade, aktin-rika myofibriller som normalt sträckta mellan somit gränser. Ett större antal laserpulser kommer dock att resultera i en kraftigt skadad somit blocket, där de flesta myofibriller förstörs. Ändå kan vi konstatera bokstavligen att &quot;tiden läker alla sår&quot;, med små skador healing snabbare än st...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle at JoVE.com

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Den metod som presenteras här omfattar exakta skada levande zebrafisk embryon med hög energi laserpulser och efterföljande analys av dessa skador och deras återhämtning med tiden. Vi visar också hur genetiskt märkta enstaka eller grupper av skelettmuskelceller kan spåras under och efter laserljus inducerad skada.

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissection av Zebrafish Embryonala Eye vävnader

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Immunfärgning av dissekerade Zebrafish Embryonala hjärta

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...