Name: quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW

Questo protocollo utilizza due configurazioni (Figura 1) per acquisire quattro letture differenti raccolti da mosche sottoposte ad una infezione batterica. Queste uscite sono 1) sonno / veglia comportamento, 2) esito di sopravvivenza; 3) carica batterica al volo e 4) misurazione in tempo reale di attività giornalista NFκB in vivo. In combinazione con gli strumenti genetici che sono disponibili in Drosophila, queste misurazioni forniscono informazioni meccanicistica sul legame molecol...

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	<li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep.">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li><li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish.">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep.">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).</li><li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+(and+why)+the+immune+system+makes+us+sleep.">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections.">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305 (2008).</li><li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila.">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).</li><li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections.">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li><li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila.">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).</li><li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li><li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster.">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li><li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila:+a+role+for+the+NFkappaB+relish.">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li><li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging.">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li><li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras/MAPK.">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li><li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relish,+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila.">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li><li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum.">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li><li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+immunity:+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways.">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li><li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. 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B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles.">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1 (2002).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila.">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).</li><li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila.">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li><li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+method+to+study+Drosophila+sleep.">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li><li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l&#39;attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l&#39;infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Incubatori </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Ogni incubatore in grado di eseguire luce programmato / orari di temperatura è appropriato. </td></tr><tr><td> Drosophila attività il Monitor </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Come descritto altrove 6, questo sistema richiede un interfaccia con il computer, il software e altri accessori. </td></tr><tr><td> Tubi di vetro Pyrex </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre scintillazione e contro luminescenza </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 Rilevatore </td><td> Qualsiasi micropiastre in grado di rilevare luminescenza può essere utilizzato per questo tipo di saggio reporter. TopCount contiene rivelatori multipli e un impilatore automatico, è in grado di essere programmato per leggere continuamente da piastre multiple. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imaging di colture batteriche è facoltativo; qualsiasi sistema di imaging digitale con capacità di luce visibile è sufficiente. </td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Forniture </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato Capillari </td><td> Mondo Precision Instrument Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Siringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Aghi per siringhe </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> G 18 - tagliare la punta dell&#39;ago per evitare di danneggiare il tubo. </td></tr><tr><td> Tubo in silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Spessore parete (0.018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Usato per fissare aghi capillare di vetro ad una siringa </td></tr><tr><td> Rubinetto a 3 vie </td><td> Azienda americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet Pestello motore a batteria </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet Pestello </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Palle di vetro da 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select piastre da 96 pozzetti che sono appropriati per luminescenza - devono essere opachi. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-pozzetti </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Micropiastre Press-On Film di tenuta adesiva </td></tr><tr><td> D-Luciferin, sale di potassio </td><td> Oro Biotechnology, Inc. </td><td> Lucna </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponibile su richiesta agli autori </td><td> personalizzato, scritto da Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab software basato che è stato utilizzato per l&#39;analisi di routine del sonno 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponibile su richiesta agli autori </td><td> personalizzato, scritto da Thomas Coradetti (Software Sidewalk) </td><td> Un MSVC6 programma per PC utilizzato per l&#39;analisi della sopravvivenza da file di dati grezzi raccolti con laTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Utile per ottenere il numero di ufc / piastra da immagini digitali (opzionale) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E &#39;generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l&#39;host durante un&#39;infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un&#39;infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l&#39;attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l&#39;infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un&#39;infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un&#39;infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all&#39;interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l&#39;infezione. L&#39;uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.

<ol><li> Infezione favorisce il sonno. In questo esempio, Canton-S (CS) mosche wild type e mosche mutanti privi di un gene NFκB, Relish (Rel E20) 14, sono stati caricati in due DAM2 controlla l&#39;attività (n = 32 per ogni genotipo) ed infettati come descritto sopra. Mosche sono stati mantenuti in luce costante per eliminare l&#39;influenza dell&#39;orologio circadiano sul comportamento e infezione 2,7,8. I mutanti sono stati E20 Rel isogenized al CS come descritto in precedenza <su...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante l&#39;infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell&#39;immunità innata, NFκB.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

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