Name: quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, Grant # IOS-1025627 e pelo Instituto Nacional de Saúde sob concessão # 1R21NS078582-01 a JAW

Este protocolo utiliza duas configurações (Figura 1) para adquirir quatro leituras diferentes recolhidos de moscas submetidos a uma infecção bacteriana. Estas saídas incluem 1) sono / vigília comportamento, 2) O resultado da sobrevivência, 3) a carga bacteriana em tempo real, e 4) em tempo real a medição de actividade de NFkB repórter in vivo. Em combinação com as ferramentas genéticas que estão disponíveis em Drosophila, estas medições fornecem uma visão mecanicista ...

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	<li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep.">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li><li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish.">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. 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S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras/MAPK.">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li><li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relish,+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila.">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. 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J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Incubadoras </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Qualquer incubadora capaz de executar luz programada / horários de temperatura é adequada. </td></tr><tr><td> Drosophila ATIVIDADE Monitores </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Conforme já descrito 6, este sistema requer uma interface de computador, software e outros acessórios. </td></tr><tr><td> Pirex de vidro Tubos </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> De cintilação de microplacas e contador de luminescência </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 detector </td><td> Qualquer leitor de microplacas capaz de detecção de luminescência pode ser utilizado para este tipo de ensaio de repórter. TopCount contém múltiplos detectores e um empilhador automático, que é capaz de ser programado para ler continuamente a partir de múltiplas placas. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imagem de culturas bacterianas é opcional; qualquer sistema de imagem digital com capacidade de luz visual é suficiente. </td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Abastecimento </td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro </td><td> Precision Instrument Inc. mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas de seringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - corte da ponta da agulha, para evitar danos na tubagem. </td></tr><tr><td> Tubulação do silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Espessura da parede (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Utilizado para a fixação de agulhas capilares de vidro para uma seringa </td></tr><tr><td> Torneira de 3 vias </td><td> Empresa americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilão Motor Cordless </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilão </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Bolas de vidro 3 milímetros </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select placas de 96 poços que são apropriados para luminescência - devem ser opacas. </td></tr><tr><td> Topseal-A Microplacas :96-bem </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaca Press-On Film vedação adesiva </td></tr><tr><td> D-luciferina, sal de potássio </td><td> BioTechnology Gold, Inc. </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponíveis mediante solicitação aos autores </td><td> personalizado, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab baseado em software que tem sido utilizada rotineiramente para a análise de sono 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponíveis mediante solicitação aos autores </td><td> personalizado, escrito por Thomas Coradetti (Software Calçada) </td><td> Um PC MSVC6 programa utilizado para a análise de sobrevivência a partir de arquivos de dados brutos coletados com oTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Útil para a obtenção do número de ufc / placa a partir de imagens digitais (opcional) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos 1 e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster 2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto 3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada 4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema 5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.

<ol><li> Infecção promove o sono. Neste exemplo, Canton-S (CS) moscas do tipo selvagem e moscas mutantes desprovidos de um gene NFkB, Relish (Rel E20) 14, foram carregados em dois DAM2 monitores de actividade (n = 32 para cada genótipo) e infectadas, como descrito acima. As moscas foram mantidas em luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano no comportamento e infecção 2,7,8. Os mutantes foram isogenized E20 Rel de CS, tal como descrito previamente 11.</s...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante a infecção bacteriana, bem como a capacidade das moscas de montar uma resposta imune pela sobrevivência de monitorização, a carga bacteriana e, em tempo real, a actividade de um regulador chave da imunidade inata, NFkB.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

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Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

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Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

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Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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