Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة R01DE018138 من المعاهد الوطنية للصحة (PX) وجزئيا من جامعة فرجينيا كومنولث الرئاسية بحوث برنامج الحوافز (PRIP) 144602-3 (PX). نشكر الدكاترة. ليو تشن، Yuetan ضو وانغ شياو جينغ لمساعدة في بناء المسوخ الجينوم واسعة. ونشكر أيضا مرفق الأساسية DNA في جامعة فرجينيا كومنولث لتسلسل الحمض النووي.

1. تصميم التمهيدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تصميم الاشعال باستخدام البرامج النصية في المنزل استنادا إلى S. الدم تسلسل الجينوم SK36. تم تصميم ثلاث مجموعات من الاشعال، F1/R1، F2/R2، وF3/R3 لتضخيم التسلسل-1 ك المنبع من الجين المستهدف، وترميز الجين <em...

<ol>
	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

للتقليل من الآثار المحتملة القطبية من استبدال جين واحد مع جين المضادات الحيوية المستهدفة الخارجية على الجينات المجاورة، وتتخذ خطوتين بينما التمهيدي الأولي تصميم. بالنسبة لمعظم الجينات حذف، فقد تم تصميم R1 الاشعال وF3 لحذف المنطقة الترميز من 6 BP بعد كودون بدء الغليان ?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; أسماء</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج #</strong</td&gt;<td<strong&gt; التعليقات (اختياري)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي F2</td&gt;<td&gt; تقنيات الحمض النووي المتكاملة</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي R2</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي F2P</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي P1</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي P2</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التمهيدي 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; المرجع نفسه</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; تسلسل: NH2-COOH-DLRGVPNPWGWIFGR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA البلمرة</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; DNA طق البلاتين البلمرة العالية والولاء</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; شركة نيو انغلاند Biolabs</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; تقييد انزيم</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; آجار</td&gt;<td&gt; Bioanalytical الأمريكية</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الاغاروز</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD العلوم البيولوجية</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; تسريب الدماغ القلب</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; حصان المصل</td&gt;<td&gt; فيشر العلمية</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; حصان المصل</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; كم</td&gt;<td&gt; فيشر العلمية</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; كاناميسين</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH مرق</td&gt;<td&gt; BD العلوم البيولوجية</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; تود هيويت مرق</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 طقم تنقية PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; QIAGEN</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; تنقية PCR QIAquick عدة</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; تصفية</td&gt;<td&gt; كورنينج</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; البوليسترين ميكرون تصفية 0،22</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; نظام Anoxomat</td&gt;<td&gt; علم الأحياء الدقيقة مارت BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat مارك الثاني</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الفوق الطرد المركزي</td&gt;<td&gt; الحرارية العلمية</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; الكتب التي أسطورة RT زائد الدوار صفيحة ميكروسكوبية</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; جل الوثائق</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-IT 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; حاضنة</td&gt;<td&gt; فيشر العلمية</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet في جل XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet في جل XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ميكروسنتريفوج</td&gt;<td&gt; إيبندورف</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; ميكروسنتريفوج 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdماصات المتعددة&gt;</td&gt;<td&gt; الحرارية Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040، 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cycler الحرارية</td&gt;<td&gt; شركة النظم البيولوجية التطبيقية</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR النظام 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

ينقول الطفرات والحذف واحد الجينات طريقتان في تطبيق خروج المغلوب الجينات في الجينوم على نطاق 1،2 البكتيريا. على الرغم من الطفرات ينقول أقل مضيعة للوقت، أقل تكلفة، ولا تحتاج إلى استكمال المعلومات الجينوم، وهناك نوعان نقاط الضعف في هذه الطريقة: (1) إمكانية حدوث طفرات متباينة في مكتبة متحولة مختلطة مكافحة يختار المسوخ مع تقليل المنافسة؛ و (2) إمكانية تعطيل الجين جزئية حيث الجينات لا تفقد وظيفتها بالكامل بعد ادراج ينقول. قد أحادية الجين التحليل حذف التعويض عن العيوب المرتبطة الطفرات ينقول. لتحسين كفاءة الجينوم على نطاق حذف جين واحد، ونحن نحاول اقامة تقنية عالية الإنتاجية للالجينوم على نطاق حذف جين واحد باستخدام الدم العقدية باعتباره النموذج الحي. كل حذف الجينات في بناء S. تم تصميم الجينوم الدم لتشمل 1-KB المنبع من الجينات المستهدفة، الجين APHA-3، ترميز البروتين المقاومة الكانامايسين، و1-KB المصب من الجينات المستهدفة. ثلاث مجموعات من الاشعال F1/R1، F2/R2، وF3/R3، على التوالي، فقد تم تصميم وتجميعها في شكل لوحة 96-PCR-جيدا لالتكبير من تلك المكونات الثلاثة للحذف كل بناء. الاشعال R1 وتحتوي على 25-F3 بي بي متواليات التي هي مكملة لمناطق الجينات-3 APHA في نهاية ال 5 هم &#39;. يتم تنفيذ A التضخيم PCR كبيرة الحجم من الجين-3 APHA مرة واحدة لخلق بنيات كل واحد حذف الجينات. في البداية تم استبعاد المروج من الجينات APHA-3 للتقليل من التأثير المحتمل للكاسيت الكاناميسين القطبية. لإنشاء بنيات حذف الجينات، يتم تنفيذ عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية في شكل لوحة 96-أيضا. وسيبذل الخطية AMPLICON PCR لكل المؤتلف حذف الجينات من خلال ردود الفعل PCR 4 عالية الدقة باستخدام البلمرة DNA. وexpon الأوليةential مرحلة نمو S. تستكمل الدم مثقف في مرق تود هيويت مع 2.5٪ يستخدم المصل الحصان المعطل لزيادة الكفاءة لتحويل PCR-المؤتلف يبني. تحت هذا الشرط، وتصل إلى 20٪ من S. يمكن أن تتحول الخلايا الدم ~ 50 نانوغرام باستخدام الحمض النووي. استنادا إلى هذا النهج، في نهاية المطاف تم الحصول على 2048 المسوخ مع احد الجينات الحذف من الجينات في 2270 S. الواردة الدم باستثناء 4 ORFs الجينات بالكامل داخل ORFs أخرى في S. الدم SK36 و 218 الجينات الأساسية المحتملة. هذه التقنية على خلق بنيات حذف الجين هو إنتاجية عالية، ويمكن أن تكون سهلة الاستخدام في الجينوم على نطاق الحذف جين واحد لأي بكتيريا التحويلية.

بعد التضخيم PCR باستخدام بادئات F1 وR1، وF3 وR3، حوالي 1-KB المنبع والمصب لكل S. تم الحصول على الدم في شكل الجينات 96-حسنا، على التوالي (الشكل 2A). لدينا في ظل ظروف PCR وباستخدام البادئات المصممة، تم تضخيم منتج معين من S. الدم في كل الحمض النووي الجيني تفاعل P...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

وقد أنشئت فعال الجينوم على نطاق طفرة جين واحد باستخدام طريقة<em&gt; العقدية الدم</em&gt; كما كائن النموذج. وقد حققت هذه الطريقة من خلال تقارير إتمام المشروعات الإنتاجية العالية المؤتلف والتحولات.

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...