Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions R01DE018138 de la National Institutes of Health (PX) et en partie par la Virginia Commonwealth University Research Programme d&#39;encouragement présidentielle (PRIP) 144602-3 (PX). Nous remercions les Drs. Lei Chen, Yuetan Dou et Xiaojing Wang pour aider à la construction de mutants du génome entier. Nous remercions également le Core Facility l&#39;ADN à l&#39;Université Virginia Commonwealth pour le séquençage de l&#39;ADN.

1. Conception Primer <ol><li> Les amorces sont conçues à l&#39;aide de scripts maison basé sur le S. séquence du génome sanguinis SK36. Trois ensembles d&#39;amorces, F1/R1, F2/R2, F3/R3 et sont conçus pour l&#39;amplification de la séquence 1-kb en amont du gène cible, la résistance aphA-3 du gène codant pour la kanamycine (Km r), et la protéine 3 1 -kb de séquence en aval du gène cible, respectivement (figure 1). Parmi ces amorces, F1 et ...

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	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

Pour minimiser les effets possibles polaires du remplacement d&#39;un gène ciblé avec le gène exogène antibiotiques sur les gènes voisins, deux mesures sont prises en amorce initiale de conception. Pour la plupart des gènes délétés, la amorces R1 et F3 sont conçus pour supprimer de la région codante de 6 pb après le codon d&#39;initiation de 30 pb avant le codon stop. Les 30 dernières paires de bases sont conservées pour protéger le potentiel du site de liaison ribosomique utilisé par le gène adjacent e...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Noms des</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogue</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires (optionnel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdR2 Primer&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPrimer&gt; F2p</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdP1 Primaire&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdP2 Primer&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Séquence: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdADN polymérase&gt;</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<tdDes enzymes de restriction&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytique américain</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sérum de cheval</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Sérum de cheval</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KM</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycine</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH bouillon</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Bouillon Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR purification kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; Kit QIAquick PCR purification</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtre</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; Filtre de 0,22 um polystyrène</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Système Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiology BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrifugeuse de paillasse</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT plus microplaque rotor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdDocumentation&gt; Gel</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubateur</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifugeuse</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifugeuse 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPipettes multicanaux&gt;</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocycleur</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Transposon mutagenèse et un seul gène suppression ya deux méthodes appliquées dans inactivation du gène du génome entier dans 1,2 bactéries. Bien mutagenèse par transposon prend moins de temps, moins coûteux, et ne nécessite pas l&#39;information du génome terminée, il ya deux faiblesses de cette méthode: (1) la possibilité d&#39;une mutants disparates dans la bibliothèque mixte mutant qui contre-sélectionne les mutants où la concurrence est diminué; et (2) la possibilité d&#39;inactivation partielle de gène par lequel les gènes ne sont pas entièrement perdent leur fonction après l&#39;insertion d&#39;un transposon. Analyse par deletion seul gène peut compenser les inconvénients liés à la mutagenèse par transposon. Pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;ensemble du génome délétion du gène unique, nous essayons de mettre en place une technique à haut débit pour l&#39;ensemble du génome délétion du gène unique à l&#39;aide sanguinis Streptococcus comme organisme modèle. Chaque délétion du gène construire dans S. sanguinis génome est conçu pour comporter 1Kb en amont du gène ciblé, le gène aphA-3, codant pour la protéine de résistance à la kanamycine et le 1-ko aval du gène ciblé. Trois ensembles d&#39;amorces F1/R1, F2/R2 et F3/R3, respectivement, sont conçues et synthétisées dans un format de plaque à 96 puits pour PCR des amplifications de ces trois composantes de chaque suppression construire. R1 et F3 amorces contiennent 25-pb des séquences qui sont complémentaires de régions de la aphA-3 du gène à leur extrémité 5 &#39;. A grande échelle amplification par PCR du gène aphA-3 est effectuée une fois pour toutes les constructions de deletion création d&#39;un seul gène. Le promoteur de gène aphA-3 est initialement exclu de réduire au minimum l&#39;effet potentiel polaire de cassette kanamycine. Pour créer les constructions de deletion du gène à haut débit amplification par PCR et la purification sont effectuées dans un format de plaque à 96 puits. Un amplicon PCR recombinante linéaire pour chaque délétion du gène sera constitué par quatre réactions PCR en utilisant l&#39;ADN polymérase haute fidélité. Le expon initialephase de croissance préférentiel de S. sanguinis cultivées en bouillon Todd Hewitt supplémenté avec 2,5% de sérum de cheval inactivé est utilisé pour augmenter la compétence pour la transformation de la PCR recombinante constructions. Sous cette condition, jusqu&#39;à 20% de S. sanguinis cellules peuvent être transformées en utilisant ~ 50 ng d&#39;ADN. Sur la base de cette approche, 2.048 mutants avec un seul gène de suppression ont finalement été obtenus à partir des gènes chez S. 2270 sanguinis l&#39;exclusion des quatre ORF du gène entièrement contenue dans d&#39;autres ORF de S. SK36 sanguinis et 218 gènes potentiels essentielles. La technique sur la création de constructions de deletion du gène est un débit élevé et pourrait être facile à utiliser dans l&#39;ensemble du génome délétions de gènes uniques pour toutes les bactéries transformables.

Après amplification par PCR en utilisant des amorces F1 et R1, R3 et F3 et, approximativement 1-kb en amont et en aval de chaque S. sanguinis gène ont été obtenus dans le format 96-puits, respectivement (figure 2A). Dans nos conditions de PCR utilisant des amorces conçues et, un produit spécifique a été amplifié à partir de S. sanguinis ADN génomique dans chaque réaction PCR. Ce résultat indique les amorces étaient très spécifiques à la cible de S. sanguinis. ...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Une échelle du génome unique efficace méthode de mutation du gène a été établie à l&#39;aide<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Comme organisme modèle. Cette méthode a réalisé via PCR à haut débit recombinantes et des transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

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Biologie

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