Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DE018138 von den National Institutes of Health (PX) und zum Teil unterstützt durch Virginia Commonwealth University Presidential Forschung Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Wir danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou und Xiaojing Wang für die Unterstützung mit dem Bau der genomweiten Mutanten. Wir danken auch dem DNA Core Facility an der Virginia Commonwealth University für die DNA-Sequenzierung.

Ein. Primer Design <ol><li> Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km r) Protein 3 und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Su...

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	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Namen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2p</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequenz: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polymerase</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Restriktionsenzym</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; American Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH Brühe</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt Broth</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filter</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 um Polystyrol-Filter</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat-System</td&gt;<td&gt; Mart Microbiology bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tischzentrifuge</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus Mikrotiterplatten Rotors</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel-Dokumentation</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubator</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Mikrozentrifuge 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mehrkanalpipetten</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR-System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien 1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5&#39;-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Pri...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Als Modellorganismus. Diese Methode wurde über einen hohen Durchsatz rekombinanten PCRs und Transformationen erreicht.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Forschung

Biologie

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...