Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
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この作品は、バージニアコモンウェルス大学研究所理事長奨励プログラム（PRIP）144602から3（PX）で、国立衛生研究所（PX）からの助成金によってR01DE018138と部分的にサポートされていました。我々は博士に感謝します。レイ·チェン、Yuetanドウとゲノムワイド変異体の構築をサポートするため、王をXiaojing。我々はまた、DNAシークエンシングのためにバージニアコモンウェルス大学でDNAの中核施設に感謝します。

1。プライマー設計<ol><li>プライマーはS.に基づいて家のスクリプトで使用して設計されてい血統 SK36ゲノム配列。プライマー、F1/R1、F2/R2、F3/R3と、3組の標的遺伝子の1-kbの上流配列を増幅するために設計されており、APHA-3をコードする遺伝子、カナマイシン耐性（キロr）はタンパク質3と1それぞれの標的遺伝子の-kbの下流配列、（ 図1）。こ?...

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	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

初期のプライマーが設計しながら、隣接する遺伝子の外因性の抗生物質遺伝子と1標的遺伝子の交換の可能性極性効果を最小限に抑えるためには、2つのステップがとられる。削除された遺伝子のほとんどは、プライマーR1とF3は前に終止コドンから30 bpに開始コドンに続く6 BPからコーディング領域を削除するために設計されています。最後の30塩基対は、隣接する下流遺伝子によって使用され?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ＃</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント（オプション）</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーF2</td&gt;<td&gt;統合DNA技術</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATGGCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーR2</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAACAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーF2P</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーP1</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーP2</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt;シーケンス：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR、-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNAポリメラーゼ</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt;プラチナTaq DNAポリメラーゼハイフィデリティ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;をEcoRI</td&gt;<td&gt;ニューイングランドバイオラボ社</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt;制限酵素</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;寒天</td&gt;<td&gt;アメリカン·バイオ分析</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アガロース</td&gt;<td&gt;プロメガ</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences社</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt;ブレインハートインフュージョン</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;馬血清</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt;馬血清</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;キロ</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt;カナマイシン</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; THブロス</td&gt;<td&gt; BD Biosciences社</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt;トッドヒューイットブロス</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR精製キット</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAクイック</td&gt;<td&gt;キアゲン</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAクイックPCR精製キット</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;フィルター</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt;0.22μmのポリスチレンフィルター</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomatシステム</td&gt;<td&gt;マート微生物BV</td&gt;<td&gt; AnoxomatマークII</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ベンチトップ遠心分離機</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt;ソーバル伝説RTプラスマイクロローター</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ゲルドキュメンテーション</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDocイット210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;インキュベーター</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 11から690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LabnetのジェルXL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; LabnetのジェルXL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マイクロ遠心機</td&gt;<td&gt;エッペンドルフ</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt;マイクロ遠心機5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マルチチャンネルピペット</td&gt;<td&gt;サーモScientfic</td&gt;<td&gt; 4661040、4661020</td&gt;<td&gt;フィンピペットF1]</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;サーマルサイクラー</td&gt;<td&gt;アプライドバイオシステムズ</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt;ジーンアンプPCRシステム9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

トランスポゾン突然変異誘発及び単一遺伝子欠失は細菌1,2におけるゲノムワイドな遺伝子ノックアウトで適用2つの方法です。トランスポゾン突然変異誘発は、低コスト、時間の無駄であり、完成したゲノム情報を必要としませんが、この方法で2つの弱点がありますが：低下競争を有する変異体をカウンターで選択された混合された変異体ライブラリー内の異なる変異体（1）の可能性が;と、（2）部分的な遺伝子の不活性化の可能性はそれによって遺伝子が完全にトランスポゾンの挿入後に、その機能を失うことはありません。単一遺伝子欠失解析は、トランスポゾン突然変異誘発に付随する欠点を補償することができる。ゲノムワイドな単一遺伝子欠失の効率を改善するために、私たちはモデル生物として連鎖球菌血統を使ってゲノムワイドな単一遺伝子欠失のためのハイスループット技術を確立しようとします。各遺伝子の欠失は、Sで構築血統ゲノムは1を備えるように設計されています標的遺伝子の-kbの上流に、標的遺伝子のカナマイシン耐性タンパク質をコードAPHA-3遺伝子、および1-kbの下流。それぞれのプライマーF1/R1、F2/R2、F3/R3と、、の3つのセットを設計し、各欠失構築物のこれらの3つのコンポーネントのPCR増幅のための96ウェルプレートフォーマットで合成される。プライマーR1とF3はそれらの5 &#39;末端APHA-3遺伝子の領域に相補的な25塩基対の配列を含む。 APHA-3遺伝子の大規模PCR増幅はすべて単一遺伝子欠失構築物を作成するために一回行われます。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、当初カナマイシンカセットの潜在的な極性の影響を最小限に抑えるために除外されます。遺伝子欠失構築物を作成するには、ハイスループットPCR増幅および精製は、96ウェルプレートフォーマットで行われます。各遺伝子欠失のための線形換えPCRアンプリコンは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて4つのPCR反応を介して構成されます。初期EXPONSの動増殖期トッドヒューイットブロス中で培養した血統は、不活化ウマ血清をPCR-換え構築物の形質転換のために能力を高めるために使用される2.5％を補足。この条件では、Sの最大20％ 血統細胞は DNAの約50 ngを使用して変換することができます。このアプローチに基づいて、単一遺伝子欠失を持つ2048の変異体は、最終的にSの2270の遺伝子から得られたSに他のORF内に完全に含まれる4つの遺伝子のORFを除く血統血統 SK36と218潜在的な必須遺伝子。遺伝子欠失構築物を作成するための技術は、高スループットであり、任意の形質転換可能な細菌のゲノムワイドな単一遺伝子欠失で使いやすいかもしれません。

後のPCRプライマーF1とR1を使用して増幅し、F3およびR3は、それぞれSの約1 kbの上流および下流血統遺伝子は、96ウェルフォーマットであった（ 図2A）で得られた。私たちのPCR条件と使用して設計されたプライマーの下では、特定の製品はSから増幅した各PCR反応における血統ゲノムDNA。この結果は、プライマーがSのターゲットに非常に特異的であっ...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されている<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;モデル生物として。この方法は、高スループット換えPCRとの変換を介して実現しています。

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...