Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações R01DE018138 dos Institutos Nacionais de Saúde (PX) e, em parte, pela Virginia Commonwealth University Programa de Incentivo à Pesquisa Presidencial (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos os drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang para ajudar com a construção de mutantes do genoma de largura. Agradecemos também o Core Facility DNA da Virginia Commonwealth University de sequenciamento de DNA.

1. Projeto Primer <ol><li> Os iniciadores são concebidos utilizando em scripts casa baseada na S. sanguinis seqüência do genoma SK36. Três conjuntos de primers, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 foram concebidos para amplificação da 1-kb de sequência a montante do gene alvo, a APHA-3 gene que codifica a resistência à canamicina (Km r) da proteína 3 e do 1 -kb de sequência a jusante do gene alvo, respectivamente (Figura 1). Entre estes iniciadores, F1 e R3 são con...

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	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

Para minimizar os possíveis efeitos polares da substituição de um gene-alvo com antibióticos gene exógeno em genes vizinhos, duas medidas são tomadas enquanto cartilha inicial de projeto. Para a maioria dos genes deletados, o R1 e F3 primers são concebidos para eliminar a região codificadora de 6 pb a seguir ao codão de iniciação para 30 pb antes do codão de paragem. Os últimos 30 pares de base são mantidas para proteger local potencial de ligação ribossomal usado por um gene adjacente a jusante. A regi?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nomes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentários (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; R2 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P1 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P2 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequência: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polymerase</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc.</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Enzima de restrição</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; American Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Horse soro</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Horse soro</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Canamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH caldo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Caldo Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; 96 PureLink kit de purificação PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; Kit de purificação PCR QIAquick</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; Filtro de 0,22 uM poliestireno</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiologia bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrífuga de bancada</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Além disso microplaca rotor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Documentação Gel</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubadora</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrífuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrífuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipetas Multicanal</td&gt;<td&gt; Thermo scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Transposon mutagênese e único gene exclusão são dois métodos aplicados no genoma nocaute de genes em 1,2 bactérias. Embora mutagénese transposon é menos demorado, menos dispendiosa, e não requer informação sobre o genoma completo, existem dois pontos fracos neste método: (1) a possibilidade de um mutantes diferentes na biblioteca misto mutante que contra-selecciona mutantes com competição reduzida; e (2) a possibilidade de inactivação parcial do gene por meio de que os genes não perder completamente a sua função após a inserção de um transposão. Single-gene análise de deleção pode compensar os inconvenientes associados com a mutagénese transposon. Para melhorar a eficiência do genoma deleção do gene único, tentamos estabelecer uma técnica de alto rendimento para o genoma de deleção do gene único usando Streptococcus sanguinis como um organismo modelo. Cada deleção do gene construir em S. sanguinis genoma foi concebido para incluir uma-Kb a montante do gene alvo, o gene APHA-3, a proteína que codifica a resistência à canamicina, e 1-kb a jusante do gene alvo. Três conjuntos de primers F1/R1, F2/R2 e F3/R3, respectivamente, foram concebidos e sintetizados de um formato de placa de 96 poços para amplificações por PCR destes três componentes de cada apagamento construir. Primers R1 e F3 conter 25-bp sequências que são complementares a regiões do gene APHA-3 no fim do seu 5 &#39;. Uma larga escala de amplificação por PCR do gene-3 APHA é executada uma vez para criar todas as construções de deleção de um único gene. O promotor do gene APHA-3 é inicialmente excluídos para minimizar o potencial efeito polar da cassete de canamicina. Para criar as construções de deleção de genes, de alto rendimento e de amplificação por PCR de purificação são realizados num formato de placa de 96 poços. Um fragmento amplificado de PCR recombinante linear para cada deleção do gene será composto por quatro reacções de PCR utilizando polimerase de alta fidelidade de ADN. O expon inicialfase de crescimento cial de S. sanguinis cultivados em caldo Todd Hewitt suplementado com soro de cavalo a 2,5% inactivado é utilizada para aumentar a capacidade para a transformação de PCR-recombinantes construtos. Sob esta condição, até 20% de S. As células podem ser transformadas sanguinis usando ~ 50 ng de DNA. Com base nesta abordagem, 2.048 mutantes com um único gene de exclusão foram finalmente obtidos a partir dos genes de S. 2270 sanguinis excluindo quatro ORFs de genes contido inteiramente dentro ORFs outros S. sanguinis SK36 e 218 potenciais genes essenciais. A técnica na criação de construções de deleção do gene é de alto rendimento e poderia ser fácil de usar em eliminações do genoma de um único gene para todas as bactérias transformáveis.

Após amplificação por PCR, utilizando iniciadores F1 e R1, R3 e F3 e, aproximadamente, 1 kb a montante e a jusante de cada um S. sanguinis gene foram obtidos em formato de 96 poços, respectivamente (Figura 2A). Sob as nossas condições de PCR e utilizando os iniciadores desenhados, um produto específico foi amplificado a partir de S. sanguinis ADN genómico em cada reacção de PCR. Este resultado indicou os primers foram altamente específico para as metas de S. sanguinis.</...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida utilizando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Como um organismo modelo. Este método tem alcançado via PCRs recombinantes de alto rendimento e transformações.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Biologia

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

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Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...