Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами R01DE018138 из Национального института здоровья (ПВ) и, частично, Virginia Commonwealth University президентской программы стимулирования исследований (Прип) 144602-3 (PX). Мы благодарим доктора. Лей Чен, Yuetan Доу и Xiaojing Ван для оказания помощи в строительстве генома широкий мутантов. Мы также благодарим фонд ДНК ядра в Virginia Commonwealth University для секвенирования ДНК.

1. Primer Design <ol><li> Грунтовки предназначены использования в доме сценарии основаны на S. sanguinis SK36 последовательность генома. Три набора праймеров, F1/R1, F2/R2, и F3/R3 предназначены для усиления 1-кб перед последовательностью гена-мишени, APHA-3 ген, кодирующий устойчивость к канамицину (Km <su...

<ol>
	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

Чтобы свести к минимуму возможные полярные эффекты замены одного целевого гена с экзогенного гена антибиотиков на соседние гены, две шаги при начальном проектировании грунтовки. Для большинства удалены гены, праймеры R1 и F3 предназначены для удаления кодирующей области от 6 б.п. после с...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Имена</strong</td&gt;<td<strong&gt; О компании</strong</td&gt;<td<strong&gt; Каталог #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Комментарии (по желанию)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Комплексная ДНК-технологии</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2p</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Последовательность: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ДНК-полимеразы</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq ДНК-полимеразы High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Рестрикционный</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Агар</td&gt;<td&gt; Американские Биоаналитическая</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Агароза</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain сердца Инфузионная</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Лошадиной сыворотки</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Лошадиной сыворотки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Канамицин</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH бульоне</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt бульоне</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 ПЦР-комплект очистки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick ПЦР-комплект очистки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Фильтр</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 мкм полистирола фильтр</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat системы</td&gt;<td&gt; Mart микробиологии BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Настольные центрифуги</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus планшет ротором</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Гель Документация</td&gt;<td&gt; UVP ООО</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Инкубатор</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet по Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet по Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Микроцентрифуга</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Микроцентрифуга 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Многоканальные пипетки</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Термоциклер</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Инк</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp ПЦР-системы 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в 1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.

После ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1, и F3 и R3, около 1-кб до и после каждого S. sanguinis генов были получены в 96-луночный, соответственно (рис. 2A). В наших условиях ПЦР и использовании предназначен грунтовки, конкретный продукт был амплифицирован из S. sanguinis ?...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; В качестве модельного организма. Этот метод осуществляется через высокую пропускную способность рекомбинантного ПЦР и преобразований.

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...