Name: genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Bu çalışma, Virginia Commonwealth Üniversitesi Başkanlık Araştırma Teşvik Programı (PRIP) 144602-3 (PX) tarafından, Sağlık (PX) Ulusal Enstitüleri ile hibe R01DE018138 tarafından kısmen desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Lei Chen, genom çapında mutantların inşaatı ile yardım için Yuetan Dou ve Wang Xiaojing. Biz de DNA dizi için Virginia Commonwealth Üniversitesi&#39;nde DNA Çekirdek Tesis ederim.

1. Primer Tasarım <ol><li> Astarlar S. dayalı ev komut kullanılarak tasarlanmıştır sanguinis SK36 genom dizisi. Primerler, F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set hedef gen, APHA-3 kodlaması, kanamisin e dirençli gen (Km r) protein 3 ve 1 1-kb yukarısında sekans amplifikasyonu için tasarlanmış sırasıyla, hedef gen, bir-kb aşağı sekansı (Şekil 1). Bu primerler arasında, F1 ve R3 programları EMBOSS paketi (içinde ePrimer3 kullanılarak tasa...

<ol>
	<li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis.">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+Bacillus+subtilis+genes.">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li><li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3'5"-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III.">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li><li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li><li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+(sic)+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization.">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li><li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1.">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis.">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li><li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect.">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li><li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci.">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis.">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li></ol>

İlk astar tasarımı sırasında komşu genler üzerinde dışsal antibiyotik gen ile bir hedef genin değiştirilmesi mümkün polar etkilerini en aza indirmek için, iki adım alınır. Silinen genlerin çoğu için, primerler R1 ve F3 önce stop kodonu ile 30 bp için başlangıç ​​kodonu takip eden 6 bp gelen kodlama bölgesindeki silmek için tasarlanmıştır. Son 30 baz çifti bitişik aşağı gen tarafından kullanılan potansiyel ribozomal bağlanma yeri korumak için korunur. Iki komşu genler arasında...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; İsimler</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar (isteğe bağlı)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar F2</td&gt;<td&gt; Entegre DNA Teknolojileri</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Astar 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Dizi: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polimeraz</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polimeraz High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Restriksiyon enzimi</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<tdBiyoanalitik&gt; Amerikan</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agaroz</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237.500</td&gt;<td&gt; Beyin Kalp İnfüzyon</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; At serumu</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; At serumu</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamisin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH broth</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249.240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt broth</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR saflaştırma kiti</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR saflaştırma kiti</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtre</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431.117</td&gt;<td&gt; 0.22 mikron polistiren filtre</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat Sistemi</td&gt;<td&gt; Mart Mikrobiyoloji bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Masa Üstü Santrifüj</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus mikroplaka rotor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Jel Dökümantasyon</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-O 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; İnkübatör</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet kullanıcısının Jel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet kullanıcısının Jel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mikrosantrifüj</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Mikrosantrifüj 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Çok Kanallı pipetler</td&gt;<td&gt; Termo scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Termal Cycler</td&gt;<td&gt; Uygulamalı Biosystems Inc</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR sistemi 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Transposon mutagenez ve tek gen delesyonu bakteriler 1,2 genom gen nakavt uygulanan iki yöntem vardır. Transposon mutagenesis, daha az zaman alan daha az maliyetli ve tamamlanmış genom bilgi gerekli değildir olmasına rağmen, bu yöntem iki zayıf vardır: azalma ile rekabet mutantlar karşı seçer ve bu karışık mutant kütüphanesi içinde bir farklı mutantların (1) olasılığı; ve (2) kısmi gen inaktivasyonu olasılığını sayede genlerin tamamen transposonun yerleştirilmesinin ardından kendi işlevini kaybetmek yok. Tek gen silme analizi transpozon mutasyon ile ilgili dezavantajları telafi edebilir. Genom tek gen delesyonu verimini artırmak için, bir model organizma olarak Streptococcus sanguinis kullanarak genom tek gen delesyonu için yüksek-throughput tekniği kurmaya çalışacaktır. Her gen delesyonu S. inşa sanguinis genom 1 ihtiva şekilde tasarlanmıştırHedefli gen, APHA-3 geni kodlayan, kanamisin e dirençli protein ve hedeflenen gen 1-kb akış aşağı-yukarı kb. Primerler F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set, sırasıyla tasarlanmış ve her bir silme, bu üç parçalarını inşa PCR büyütmesi için-96-kuyucuklu bir plaka biçiminde sentezlenir. Primerler, R1 ve F3 kendi 5 &#39;ucunda APHA-3 gen bölgeleri için tamamlayıcı olan 25-bp sekanslar içerir. APHA-3 geninin büyük ölçekli bir PCR amplifikasyon tüm tek gen silme yapıları oluşturmak için bir kez gerçekleştirilir. APHA-3 geninin promotörü başlangıçta kanamisin kaseti potansiyel kutup etkisini en aza indirmek için dahil edilir. Gen silme yapıları oluşturmak için yüksek verimli, PCR saflaştırma 96 çukurlu bir levha formatında gerçekleştirilir. Her gen delesyonu için doğrusal bir rekombinant PCR amplikon yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılarak dört PCR reaksiyonları aracılığıyla yapılacaktır. Ilk exponS. ential büyüme fazı % 2.5 inaktive at serumu PCR-rekombinant yapıların dönüşümü için yeteneklerini artırmak için kullanılan Todd Hewitt broth kültürü sanguinis desteklenmiştir. S. Bu koşul altında,% 20&#39;ye kadar sanguinis hücrelerin DNA ~ 50 ng kullanılarak dönüştürülebilir. Bu yaklaşıma göre, tek gen silinmesi ile 2.048 nihai mutant S. 2.270 genler elde edildi dört gen ORF hariç sanguinis S. başka ORF tamamen kaplayabilir sanguinis SK36 ve 218 potansiyel elzem genler. Gen delesyonu yapıları oluşturma konusunda teknik, yüksek verim ve herhangi bir dönüştürülebilir bakteri genomu tek gen delesyonlar kullanımı kolay olabilir.

Sonra PCR primerleri, F1 ve R1 kullanılarak amplifikasyon, ve F3 ve R3&#39;ün her biri S. yaklaşık 1 kb yukan ve aşağı sanguinis gen 96-gözlü formata, sırasıyla (Şekil 2A) halinde elde edildi. Bizim PCR koşulları ve kullanılarak tasarlanmış primerler altında, belirli bir ürün S. amplifiye edildi Her bir PCR reaksiyonu içinde sanguinis genomik DNA. Bu sonuç primerlerin S. hedeflerine çok özel olduğunu göstermiştir sanguinis....

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR at JoVE.com

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Bir model organizma olarak. Bu yöntem yüksek verimlilik rekombinant PCR ve dönüşümler yoluyla elde etti.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...