Name: isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בפרס R01 HL105734 לVVPMDL נתמך, בין שאר, על ידי המכון הלאומי לבריאות בקריירה מחקר פרס K08 HL094748. VVP הוא חוקר חדשני של איגוד הלב האמריקאי נתמך על ידי מענק 11IRG900384.

.1 הכנת הפתרונות וציוד הדרושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לעקר את מכשירי ניתוח (מלקחיים ישרים צורה, מלקחיים צורה מעוגלות, מספריים צורה ישרות, ומספריים צורה מעוגלות) על ידי המעוקר במשך 15 דקות. ב 121 C °. להכין 2 סטים של מכשירים, שבו קבוצה אחת משמ...

<ol>
	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

מלנוציטים לב נמצאים במקומות אנטומיים בתוך הלב, כי בדרך כלל לגרום לטריגרים הפרעות קצב פרוזדורים. אזורים אלה כוללים את ורידי ריאה, annulus בין העליות והחדרים, המבואה האחורית עזב וovale הנקב (איור 4). כדי להבין את תפקיד תאים אלה לשחק בarrhythmogenesis, אנו מפתחים טכניקות לבודד...

לאחרונה זיהו אוכלוסיית תא רומן בלב של עכברים ובני האדם שמבטאים את אנזימי מלנין-סינתזה ומורפולוגית דומה מלנוציטים עורית. אנו נקראים &#39;מלנוציטים הלב&#39; התאים אלה ומצאנו שהם נמצאים במקומות אנטומיים שממנו הפרעת קצב פרוזדורים מתעורר בי לעתים קרובות מקורן בבני אדם. מצאנו גם מלנוציטים לב לתרום להפרעות קצב פרוזדורים בעכברים עם מחיקה בתאי מין של DCT. מלנוציטים לב מופצים בדלילות לאורך אטריום העכבר שבו הם מהווים פחות מ -0.1% מכל תאי פרוזדורים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר באמצעות סמנים ספציפיים melanocyte Cre-מושרה. ההליך הראשוני שלנו פותח מאלו המשמשים לבודד את שריר לב עכברי בילוד ומספרים קטנים מאוד הניבו של תאים מתאימים להקלטות מהדק תיקון או ניתוח PCR. עם זאת, על מנת לשפר את לרפאה ואת הכדאיות של מלנוציטים לב, ליותר בניתוח המעמיק אלקטרו או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן מאלה שנועדו לבודד את מלנוציטים עורית. יש ההליך המתואר והפגין בסקירה זו את היתרון של ייצור מלנוציטים לב בריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

זיהינו אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורמים לגורמי הפרעת קצב פרוזדורים בעכברים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר שנגזרים מאלה שנועדו לבודד את שריר לב עכברי בילוד. על מנת לקבל מלנוציטים לב בריאים מתאימים למהדק תיקון נרחב יותר או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן לבידוד וציפוי מלנוציטים לב המבוססים על אלה שתוכננו במקור לבודד מלנוציטים עורית. ההליך המעודן בא לידי הביטוי בסקירה זו ומייצר מספרים גדולים יותר של תאים כמו melanocyte הבריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא טכניקה משופרת בהשוואה לזו שפורסמנו בעבר לבידוד מלנוציטים לב מהלב העכברי. הליך זה מעסיק את השימוש של סמני ניאון מונעים על ידי Cre-recombinase אנזים ספציפי סינתזת מלנין לתייג תאים כמו melanocyte-לב. חשוב להשתמש בסמן כדי לתייג מלנוציטים לב כאשר עובדים ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...