Name: isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of award Salute R01 HL105734 a VVPMDL è supportato, in parte, dal National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP è un ricercatore innovativo della American Heart Association sostenuta da sovvenzioni 11IRG900384.

1 Preparare le soluzioni necessarie e attrezzature <ol><li> In primo luogo, sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze diritte forma, pinze forma curva, forbici forma diritta, e forbici forma curva) da loro autoclave per 15 min. a 121 ° C. Preparare 2 set di strumenti, in cui viene utilizzato un set per sezionare i cuori e l&#39;altro insieme saranno utilizzati per tritare il tessuto. </li><li> Sciogliere 1 bustina di MCDB153 cultura media in 900 ml di sterile, acqua filtrata e mescolare lentamente fino a che la po...

<ol>
	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

Melanociti cardiache sono presenti in sedi anatomiche all&#39;interno del cuore che spesso danno luogo a trigger aritmie atriali. Queste regioni comprendono le vene polmonari, l&#39;anello atrioventricolare, posteriore sinistra dell&#39;atrio e del forame ovale (Figura 4). Per comprendere il ruolo di queste cellule svolgono in aritmogenesi, sviluppiamo tecniche per isolare loro e studiare la loro fisiologia. Tuttavia, abbiamo riconosciuto che il miglioramento di questa tecnica a cedere quantitativi più...

Abbiamo recentemente identificato una popolazione di cellule romanzo nel cuore di topi e gli esseri umani che esprimono enzimi melanina-sintesi e morfologicamente assomigliano melanociti cutanei. Abbiamo chiamato &#39;melanociti cardiaci&#39; queste cellule e l&#39;ho trovato sono presenti in posizioni anatomiche da cui aritmia atriale trigger spesso origine negli esseri umani. Abbiamo anche trovato melanociti cardiaci contribuiscono ad aritmie atriali nei topi con delezione linea germinale di Dct. Melanociti cardiache sono scarsamente distribuiti in tutto l&#39;atrio del mouse dove essi costituiscono meno dello 0,1% di tutte le cellule atriali. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dal cuore mouse utilizzando marcatori specifici melanociti Cre-inducibile. La nostra procedura iniziale è stato sviluppato da quelli utilizzati per isolare cardiomiociti murini neonatali e fruttate molto piccolo numero di cellule adatti per le registrazioni di patch clamp o analisi PCR. Tuttavia, per migliorare la guarigioneesima e la vitalità dei melanociti cardiaci, per più approfondita analisi elettrofisiologica o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata da quelli progettati per isolare melanociti cutanei. La procedura descritta e dimostrata in questa recensione ha il vantaggio di produrre sani melanociti cardiaco che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

Abbiamo identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono a trigger di aritmia atriale nei topi. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dai cuori di topo che derivati ​​da quelli progettati per isolare cardiomiociti murini neonatali. Al fine di ottenere melanociti cardiache sane adatte per una più ampia patch clamp o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata per isolare e placcatura melanociti cardiaci basati su quelli originariamente progettato per isolare melanociti cutanei. La procedura raffinata è dimostrato in questa recensione e produce un numero maggiore di cellule melanociti-come sani che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.

Il protocollo descritto in questo articolo è una tecnica migliorata rispetto a quella che abbiamo già pubblicato per isolare melanociti cardiache dal cuore murino. Questa procedura impiega l&#39;uso di marcatori fluorescenti guidati da sintesi della melanina specifica-enzima Cre-ricombinasi di etichettare cellule melanociti-simile cardiaci. E &#39;importante utilizzare un marcatore per etichettare melanociti cardiaci quando si lavora con le cellule embrionali o neonatali appena isolate, dal momento che le differenze m...

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Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.

Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

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