Name: isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health award R01 HL105734 til VVPMDL støttes delvis av National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP er en innovativ Forsker av American Heart Association støttet av tilskudd 11IRG900384.

1. Forberede de nødvendige løsninger og utstyr <ol><li> Først sterilisere kirurgiske instrumenter (rett form tang, buede formen tang, rett form saks, og buede formen saks) ved autoklavering dem for 15 min. ved 121 ° C. Forbered 2 sett med instrumenter, der ett sett brukes til å dissekere ut hjertene og det andre settet skal brukes til hakking opp vevet. </li><li> Løs opp 1 pakke MCDB153 kultur media i 900 ml sterilisert, filtrert vann og rør sakte til pulveret er oppløst. Tilsett 1,2 g natrium-bikarbonat, elle...

<ol>
	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

Hjerte melanocyttene er tilstede i anatomiske steder i hjertet som ofte gir opphav til atrial arytmi triggere. Disse områdene omfatter lungevenene, atrioventrikulær ringrom, bakre venstre atrium og foramen ovale (figur 4). For å forstå hvilken rolle disse cellene spiller i arrhythmogenesis, vi utvikler teknikker for å isolere dem og studere deres fysiologi. Men vi anerkjent som å forbedre denne teknikken til å gi sunnere og større mengder av hjerte melanocytter ville tillate videre studier for ?...

Vi har nylig identifisert en roman cellepopulasjon i hjertet av mus og mennesker som uttrykker melanin-syntese enzymer og morfologisk ligner kutane melanocytter. Vi kalte disse cellenes kardiale melanocytter &#39;og funnet at de er tilstede i anatomiske steder hvorfra atrial arytmi utløser ofte har sin opprinnelse i mennesker. Vi fant også hjerte melanocyttene bidra til atriearytmier i mus med germline sletting av Dct. Hjerte melanocyttene er tynt fordelt over hele musen atrium der de utgjør mindre enn 0,1% av alle atrial celler. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra musen hjertet ved hjelp av Cre-induserbar melanocyte spesifikke markører. Vår første prosedyren ble utviklet fra de som brukes til å isolere neonatale murine cardiomyocytes og gitt meget lite antall celler egnet for patch clamp opptak eller PCR analyse. Imidlertid, for å forbedre helbredeth og levedyktighet av hjerte melanocytter, for mer dyptgående elektrofysiologisk analyse eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert prosedyren fra de som er laget for å isolere kutane melanocytter. Den fremgangsmåte som er beskrevet og vist i dette har fordelen av å produsere sunnere hjerte melanocytter som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

Vi identifiserte en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi triggere i mus. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra mus hjerter at vi stammer fra de som er laget for å isolere neonatale muse kardiomyocytter. For å få sunnere hjerte melanocytter egnet for mer omfattende patch clamp eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert metode for isolering og plating hjerte melanocytter basert på de som opprinnelig laget for å isolere kutane melanocytter. Den raffinerte fremgangsmåten er vist i dette og gir et større antall friske melanocyte-lignende celler som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.

Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er en forbedret teknikk i forhold til det vi tidligere utgitt for å isolere hjerte melanocytter fra murine hjerte. Denne fremgangsmåte anvender bruken av fluorescerende markører drevet av melanin syntese enzym-spesifikke Cre-rekombinase for å merke kardiale melanocyte-lignende celler. Det er viktig å bruke en markør for å merke hjerte melanocytter når du arbeider med fersk isolerte embryonale eller neonatale celler, siden de morfologiske forskjeller som skiller hjerte ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

I denne protokollen, w e identifisert en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi utløser hos mus.

Isolere Primær melanocytter lignende celler fra mus Hjerte

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Påvisning av nitrogenoksid og Superoxide Radical anion med Electron paramagnetisk resonans spektroskopi fra celler ved hjelp av Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Protein Isolasjon fra utviklings Embryonic Mouse hjertet ventil Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering og karakterisering differensiering av Cardiac stamceller fra voksen mus hjertet

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...