Name: isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health utmärkelse R01 HL105734 till VVPMDL stöds delvis av National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP är ett innovativt forskare på American Heart Association med stöd av bidrag 11IRG900384.

1 Förbereda nödvändiga lösningar och utrustning <ol><li> Först sterilisera kirurgiska instrument (rak form tänger, krökt form tänger, rak form sax och krökt form saxar) genom autoklavering av dem under 15 min. vid 121 ° C. Förbered två uppsättningar instrument, där en uppsättning används för att dissekera ut hjärtan och den andra uppsättningen kommer att användas för malning upp vävnaden. </li><li> Lös 1 paket MCDB153 odlingsmedier i 900 ml steriliserat, filtrerat vatten och rör om långsamt ti...

<ol>
	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

Hjärtat melanocyter finns i anatomiska platser i hjärtat som vanligtvis ger upphov till förmaksarytmi triggers. Dessa områden innefattar lungvenerna, det atrioventrikulärt ringen, den bakre vänster förmak och foramen ovale (Figur 4). För att förstå vilken roll dessa celler spelar i arrhythmogenesis utvecklar vi metoder för att isolera dem och studera deras fysiologi. Dock erkände vi att förbättra denna teknik för att ge friskare och större mängder av hjärt melanocyter skulle tillåta y...

Vi identifierade nyligen en ny cellpopulation i hjärtat av möss och människor som uttrycker melanin-syntesenzymer och morfologiskt liknar kutan melanocyter. Vi kallade dessa cellers hjärt melanocyter &quot;och hittade de ingår i anatomiska platser från vilka förmaksarytmi utlöser ofta sitt ursprung i människor. Vi fann också hjärt melanocyter bidrar till förmaksarytmier i möss med könsceller radering av Dct. Hjärt melanocyter är glest fördelade i musen atrium där de utgör mindre än 0,1% av alla förmaksceller. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från musen hjärtat med hjälp av Cre-inducerbart melanocytstimulerande specifika markörer. Vår inledande förfarandet utvecklades från dem som används för att isolera neonatal murina cardiomyocytes och gav ett mycket litet antal celler lämpliga för patch clamp inspelningar eller PCR-analys. Emellertid, för att förbättra läkae och livskraft hjärt melanocyter, för mer djupgående elektrofysiologiska analyser eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad proceduren från sådana som är konstruerade för att isolera kutan melanocyter. Det förfarande som beskrivs och demonstreras i denna genomgång har fördelen att producera friskare hjärt melanocyter som kan pläterade som en ren population eller med kardiomyocyter.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

Vi identifierade en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi triggers i möss. För att undersöka de elektriska och biologiska egenskaper hjärt melanocyter vi utvecklat ett förfarande för att isolera dem från mus hjärtan som vi kommer från sådana som är konstruerade för att isolera neonatal murina cardiomyocytes. För att få hälsosammare hjärt melanocyter lämpliga för mer omfattande patch klämma eller biokemiska studier, utvecklade vi en raffinerad förfarande för isolering och plätering hjärt melanocyter baserade på dem ursprungligen för att isolera kutan melanocyter. Den raffinerade förfarande demonstreras i denna översyn och ger större antal friska melanocytstimulerande liknande celler som kan pläterade som en ren population eller med hjärtmuskelceller.

Protokollet beskrivs i denna artikel är en förbättrad teknik i jämförelse med den som vi tidigare publicerat för att isolera hjärt melanocyter från murina hjärtat. Detta förfarande sysselsätter användningen av fluorescerande markörer som drivs av melaninsyntes enzymspecifika Cre-rekombinas att märka hjärt melanocytstimulerande liknande celler. Det är viktigt att använda en markör för att märka hjärt melanocyter vid arbete med nyligen isolerade embryonala eller neonatala celler, eftersom de morfologi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

I detta protokoll w e identifierat en ny population av melanocytstimulerande liknande celler (även känd som hjärt melanocyter) i hjärtat hos möss och människor som bidrar till förmaksarytmi utlöser hos möss.

Isolera Primära melanocyt liknande celler från mus Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primär kultur Vuxen myocyter Rat hjärta

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Isolera stamceller från Soft Muskuloskeletala vävnader

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogena analysen: Vidhäftande Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detektering av kväveoxid och superoxidradikalanjonen genom elektronparamagnetisk resonans-spektroskopi från celler med användning av spin traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Protein Isolering från utvecklings Embryonala Mus hjärtklaff Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller från vuxna mus hjärtat

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...