Name: manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses at JoVE.com

Arbejdet blev støttet af R01 DC 011.582 (AK) og RO1 DC011555 (DJT).

<ol><li> Træk glaselektroder Pull glaselektroder <ol><li> Pull enkelt tønde elektrode. Brug enkelt tønde glaskapillar med filamentet og træk spids til en diameter på omkring 1-2 mikrometer, stav på 10-12 mm og tilhørende elektrode modstand på omkring 12 MOhm (interval 5-20 MOhms) som målt i 0,9% NaCI-opløsning. Nedre elektrode modstande ville resultere i mere baggrund aktivitet og dermed mere problemer med at isolere ensartet aktivitet fra de enkelte neuroner. Til at trække denne elektrode, bruge enten en vandret eller en lodret aftrækker med enten varme filamenter eller varmeslanger. </li><li> Pull multibarrel elektrode. På grund af den meget større diameter multibarrel glas og behovet for jævn varmefordeling omkring hele multibarrel, er en kraftig aftrækker med en større diameter varmespiral, ikke en opvarmning filament, nødvendig. En multibarrel pipette skal anbringes i centrum af opvarmningen filament med no kontakt til varmefladen. Bemærk, at ud over de 5-tønde pipetter her beskrevne 3-tønde eller 7-tønde pipetter er kommercielt tilgængelige alternativer. Pull glas til en pipettespids på omkring 10 mikrometer total diameter eller mindre. Spidsen vil blive brudt til den korrekte diameter i det næste trin, så den nøjagtige tip størrelsen er mindre kritisk under optrækningen proces end den samlede form af elektrodespidsen, som bør være lang og relativt tyndt. Der henvises til billedet i figur 1C til den ønskede elektrodespidsen form. Korte og stumpet elektrode figurer (figur 1 B) vil forårsage en væsentlig mængde af vævsbeskadigelse når frem til hjernen, mens meget lange og tynde elektroder former (figur 1A) vil bøje og således vil gøre det vanskeligt at bryde elektrodespids til den korrekte diameter (se trin 2). </li></ol></li><li> Rediger Elektrode Tips Ændre elektrode tips. Før de to elektroder kan limes sammen, Skal de modificeres. Skaftet af enkelt elektrode skal bukkes før det kan fastgøres til multibarrel for at sikre den samlede aksel af det færdige piggy-back elektrode er så tynde som muligt. Desuden spidsen af ​​multibarrel elektroden skal brækkes af, for at sikre lav modstand for iontoforese. <ol><li> Bøj aksel af en enkelt cylinder elektrode ved omkring 20 grader. Brug mindste Bunsen brænderflammen muligt. Typiske &quot;små&quot; bunsenbrændere fra standard lab forsyningsselskaberne skaber flamme størrelser, der er alt for stor til denne ansøgning. For at omgå dette problem anvender den mindste kommercielle bunsenbrænder og sikre en sprøjtenål ​​(~ 18 gauge) til toppen af ​​brænderen og tætne samlingen med dentalcement. Når den betjenes, skal flammen være svært at se, omkring 5 mm eller mindre i diameter og omkring 8 mm høj. Enhver luftbevægelse i rummet vil slukke den flamme, så det er en god idé at betjene brænderen i enlukket rum, eller for at bruge vind skjolde. Flyt enkelt tønde elektrode gennem flammen at bøje den ved omkring 20 grader. Tilstræbes, at brænderens flamme smelte glasset ved overgangen område på omkring 10 mm væk fra elektrodens spids. For at undgå smeltning af spidsen af ​​elektroden foreslår vi, at elektroden holdes på omkring 45 grader, spidsen pegende nedad, og flytter elektroden gennem flammen relativt hurtigt. </li><li> Bræk spidsen af multibarrel elektroden. For at sikre en visuel kontrol, mens bryde elektrodespidsen, anvendes et mikroskop med mindst 10x objektiv og 10x okularer. En måling skala indsat i okulære vil også være behov for at måle dysestørrelser. Vedhæfte et stykke plexiglas til mikroskopet, således at enden af ​​plexiglas kan ses i omkring en tredjedel til halvdelen af ​​synsfeltet for mikroskopet. I vores tilfælde er plexiglas stykke omkring 25 x 70 mm og 5 mm tyk og fastgjort via en skrue, der kan fastgøres til en brugerdefineretgjort tråd i mikroskopbordet. Det er vigtigt at have et design, der gør det muligt at plexiglas bevæger sig uafhængigt af objektglasset. Placer multibarrel elektrode i en seng af modellervoks på en glasplade, og indsæt det dias, der indeholder elektroden i mikroskopbordet s diasholderen. Brug af mikroskopbordet er xy manipulatorer, flytte forsigtigt elektroden spidsen mod plexiglas stykke, og observere at bryde spidsen gennem mikroskopet okularer. Forsøg at rent bryde multibarrel tip til en kumulativ diameter på ca 25-35 mikrometer. Kassér pipetter med tip diametre der brød ud for stor, eller tips med ujævne pauser. Vi skille 30% af vores multibarrel elektroder på grund af uønskede spids figurer. </li></ol></li><li> Saml Piggy-back Elektrode Saml piggy-back elektrode. <ol><li> Position elektroder. Fjern plexiglas stykke anvendt i trin 2.2 fra mikroskopbordet. Sikker afsluttetmultibarrel elektrode i modellering ler på en glasplade, spids peger en smule opad. Peger opad vil være vigtigt for trin 3.2, til limning af de to elektroder. Tips, der peger op få lim til at løbe væk fra spidsen, undgå lime elektroden tips. Indsæt bøjet enkelt tønde elektrode ind i elektrode indehaveren af den specialfremstillede mikromanipulator (figur 2). Brug af visuel vejledning først og derefter mikroskopisk vejledning, sænke enkelt tønde elektroden på multibarrel elektroden. Den indre elektrode bør sænkes direkte ind i rillen, der er dannet ved arrangementet af de fem tønder, med spidsen rager spidsen af ​​multibarrel spids ved omkring 5-10 mikrometer. Ved sænkning af det indre tønde, nøje følge den vinkel, der dannes mellem de to elektroder. For bedste resultat undgå vinkler, hvor spidserne peger væk fra hinanden, men forsøger at sænke enkelt elektrode på multi fuldkommen parallelle eller endog med spidsenrører multibarrel først, danner en meget lille &quot;kile&quot; arrangement. Da den indre tønde spidsen er meget fleksibel, vil det bøje, når den indre elektrode er sænket lidt længere, efter at spidsen har nået den øvre overflade af multi tønde elektroden, dannelse af et rent sammensat spids, der har en lille mængde fjedervirkning indbygget der hjælper holde spidserne sammen. Hvis vinklen mellem indre tønde og multibarrel elektrode er for stejl (for meget af en kile), vil fjedervirkningen være for høj, og bøj elektrodearrangementet nedad. </li><li> Lim elektrode aksler sammen. Lim aksler af de to elektroder sammen med cyanoacrylat (superlim). Placere en lille dråbe lim på den lille side af en flade tandstikker og tryk elektrodeaggregat med limen drop. Start ved stillingen mest distale af de tips og langsomt bevæge tandstikker med lim drop langs elektrode skakter mod elektrode tips. Brug for meget lim eller anvende lim too tæt ved elektrodespidserne vil resultere i at lime elektrode åbninger, hvilket gør elektroden i det mindste delvist ikke-funktionelt. </li><li> Stabilisere fælles med dentalcement. Bland en lille mængde af dentalcement og dental acrylic i en lille engangs plastik skål eller vejer båd, med en flad tandstik. Vent cement bliver formbar og anvende en lille mængde til samlingen mellem de to elektroder til at stabilisere leddet (pink materiale i figur 3). Tillad omkring 15 min for at tørre. </li><li> Fjerne og opbevare elektroden. Fjern forsigtigt den udfyldte piggy-back elektrode først fra mikromanipulator holderen, og derefter løsnes fra objektglasset, og opbevares i en støvtæt beholder. </li></ol></li><li> Forbered Elektrode Fyld Solutions Fremstille elektroden fill løsninger. Da iontoforese kræver ladede molekyler, de fleste midler skal opløses enten i et surt eller alkalisk miljø (typisk enta pH på 3-4, eller et pH på omkring 8-10, henholdsvis). En række kemikalier, der ofte anvendes i iontophorese er opført i tabel 1. For midler, der ikke findes i tabellen, afgøre, fra pKa-værdien, om det ville være lettere at anvende molekylet i et surt eller alkalisk miljø til at holde molekylet opladet, og opløses derefter. For de bedste resultater, bland alle løsninger frisk hver dag. </li><li> Fyld og Forbered Elektroder Fyld og forberede elektroder. Lige før anvendelse af elektroden, back fylde hver tønde med dens respektive lægemiddel, ved hjælp af kulfiber 28-34 gauge nåle fastgjort til sprøjter med sprøjtefiltre. Fyld de 4 ydre tønder af 5-tønde konfiguration med narkotika af valg, og centret tønde med 3M NaCl som en afvejning tønde. Fyld enkelt tønde optagelse elektrode med 3M NaCl så godt. Tilsætning af et farvestof til NaCl-opløsning, såsom fast green eller phenolrødt vil gøre det lettere at se elektrodespidsenunder placering af elektroden på hjernen overflade. Sæt elektroden i elektrodeholderen af ​​optagelsen setup og indsætte alle ledninger i de relevante glas tønder. Brug isoleret sølvtråd hvorfra omkring 1 cm for isolering er blevet fjernet ved spidsen. Der bør være fem ledninger til multibarrel elektroden (4 stof tønder og en balancering tønde), plus forstærkeren ledning, der skal indsættes i optagelsen enkelt tønde elektrode. </li><li> Tænd iontophorese pumpemoduler Tænd iontoforese pumpemoduler og teste alle de tønder. Elektroden test funktion af hvert pumpemodul hjælper til at bestemme, om elektroden cylinderen er funktionel. At forhindre lækage af lægemidlerne fra tønder når den ikke bruges, en tilbageholdelse spænding i den modsatte polaritet som molekylet ladning skal anvendes. </li></ol>

<ol>
	<li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assembly+of+"parallel"+micro-pipettes.">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li><li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel.">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li><li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra.">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li><li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+constructing+"piggy-back"+multibarrel+microelectrodes.">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li><li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes.">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li><li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes.">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li><li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons:+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input.">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus.">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus:+implications+for+encoding+sound+location.">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li><li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus.">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li><li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus.">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li><li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus:+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation.">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124 (2001).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus.">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus.">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li><li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons:+iontophoretic+studies.">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li><li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons.">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li><li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus.">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li><li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus.">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li><li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat.">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li><li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons.">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li><li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus:+facilitated+combination-sensitive+neurons.">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li><li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons.">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li><li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats.">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li><li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus.">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li><li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus.">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi beskriver en teknik, som muliggør manipulation af en enkelt neuron s mikrokredsløb in vivo, mens den på samme tid tillader optagelsen af neuron reaktioner under den eksperimentelle manipulering. Neurale kredsløb manipuleres via iontophoretical anvendelse af synaptiske agonister og antagonister. Den største fordel ved iontoforese overtryk udslyngning er, at iontoforese ikke kræver fysisk flytning af fluid fra elektroden i neurale væv, og derfor er der ingen bekymring for at forårsage vævsskade ved det påførte tryk eller væskevolumen. Den største begrænsning ved denne teknik er manglende information om den absolutte lægemiddelkoncentration i væv, og mængden af ​​væv påvirkes. Da mængderne af farmakologiske midler udstødes med iontoforese er meget mindre og langt mere præcist kontrollerbart end med tryk udstødning, til nyttiggørelse fra Drug Application er typisk meget hurtigere end langt mere komplet. Microiontophoresis har med succes været anvendt i en række neurale systemer, sensoriske og andre, og at den anvendes mest held i hjerneområder med ringe eller ingen iboende forarbejdning. Årsagen er, at en del af den udstødte farmakologisk middel kan diffundere fra påføringsstedet til et tilstødende neuron og også manipulere respons egenskaber tilstødende neuron. Den separate fremstilling af enkelt-og multi tønde elektroder giver mulighed for en kombination af elektroder med vilkårlige og uafhængige egenskaber. Trække elektrode tønder sammen og bruge nogle til optagelse og nogle for iontophoretiske formål ville producere elektrodespidserne med meget lignende egenskaber, således at elektrodespidserne enten ville være for stor til en enkelt celle optagelse, eller for lille for narkotika ansøgning. Desuden har den indre cylinder spids strækker sig ud over multibarrel elektrodespidserne ved omkring 20 mikrometer reducerer støj i optagelserne, end eliminerer eventuelle konfunderende nuværende virkninger fra opbevaring eller udstødning strømme på neuron s fyring 3. Piggy-back multibarrel elektroder først er blevet beskrevet over 30 år siden 4-6 og er blevet brugt med stor succes til at dissekere neurale kredsløb 7-18 19-29. Den metode per se er ikke nye eller unikke. Imidlertid har de særlige detaljer i elektroden fremstilling og anvendelse er blevet modificeret gennem årene, og mængden af ​​instruktioner beskrives her, har vist sig at være særlig let og vellykket, og er ikke blevet offentliggjort i detaljer andetsteds i litteraturen. Især angår bøjning af det indre tønde elektrodespidsen tillader den endelige spidsen af piggy-back elektrode skal være forholdsvis tynd (fig. 3), og tillader således for optagelser fra dyb kerner med minimal skade på hjernen, den udragende det indre tønde elektrode over multi-tønde elektrode fjerner stort set alle valut ejendele, der blev ofte nævnt som en ulempe ved teknikken 3. Nye detaljer præsenteres her, såsom at have elektrode spidsen pegende opad under limning processen og hvile den enkelte tønde i rillen i multibarrel elektrode vil sikre en høj succesrate ved produktion piggy-back elektroder. Teknikken er forholdsvis let og kan typisk beherskes af en nybegynder inden for få dage.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vare navn </td><td> Producent </td><td> Kommentar </td><td> Kat. # </td></tr><tr><td> Bunsenbrænder </td><td></td><td> Tilgængelig fra: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> Tokomponent dentalcement: &quot;Cold kur&quot; dentalmateriale </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Tilgængelig fra: AM Systems, Inc </td><td> 525.000 </td></tr><tr><td> Tokomponent dentalcement: tandprotesemateriale tværbinding væskeblanding </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Tilgængelig fra: AM Systems, Inc </td><td> 525.000 </td></tr><tr><td> Flydende lim </td><td> Henkel </td><td> Tilgængelig fra: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> Mikro-Iontoforese Unden: Neurophore BH-2 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Tilgængelig fra: Harvard Apparatus </td><td> 65-0200 &amp; 65-0203 </td></tr><tr><td> Isolerede sølvtråd </td><td> AM-Systems </td><td> Tilgængelig fra: AM-Systems </td><td> 785.500 </td></tr><tr><td> Vandret aftrækker </td><td> Zeitz DMZ-Universal Puller </td><td> Tilgængelig fra: Automatiser Scientific </td><td> NA </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: elektrodeholder </td><td> WPI </td><td> Tilgængelig fra: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: lineær fase </td><td> Newport 423 Series </td><td> Tilgængelig fra: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: rotation fase </td><td> Newport RSP-2 </td><td> Tilgængelig fra:Newport </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: z oversættelse </td><td> Newport 433 Series </td><td> Tilgængelig fra: Newport </td><td> 433 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: Vinkelbeslag 90 ° at samle z og xy aksen </td><td> Newport 360-90 </td><td> Tilgængelig fra: Newport </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: x oversættelse / lineær fase </td><td> Newport 423 Series </td><td> Tilgængelig fra: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stykker: y oversættelse / lineær fase </td><td> Newport 423 </td><td> Tilgængelig fra: Serie Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Leitz Laborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> Microscope: målsætning </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25 </td><td></td><td> 519.760 </td></tr><tr><td> Microscope: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 </td><td></td><td> 519.748 </td></tr><tr><td> Microscope: trin </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513.544 </td></tr><tr><td> Multibarrel kapillær </td><td> N / A </td><td> Tilgængelig fra: AM-systemer, Inc </td><td> 612.000 </td></tr><tr><td> Sinlge tønde kapillær (GC 150F-10) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Tilgængelig fra: Harvard Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> Lodret aftrækker </td><td> Narishige model PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Specialfremstillede dele af Micro-manipulator (markeret lys blue i figur 1) </td><td></td></tr><tr><td> stålplade </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> vippefod </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> fastgørelse til elektrodeholder </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tabel 2. Producenter og varenumre for alt udstyr og forsyninger, der anvendes i proceduren. </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

In vivo optagelser fra enkelte neuroner tillade en efterforsker til at undersøge fyring egenskaber af neuroner, for eksempel som svar på sensoriske stimuli. Neuroner typisk modtager flere excitatoriske og inhiberende afferente og / eller efferente indgange kan integreres med hinanden, og de endelige målte reaktion egenskaber neuron er drevet af de neurale integrationer af disse indgange. At studere informationsbehandling i neurale systemer, er det nødvendigt at forstå de forskellige input til en neuron eller neurale system, og de specifikke egenskaber af disse inputs. En kraftig og teknisk forholdsvis enkel metode til at vurdere den funktionelle rolle af visse input at en given neuron modtager er til dynamisk og reversibelt undertrykke eller eliminere disse indgange, og måle ændringer i neuron output forårsaget af denne manipulation. Dette kan opnås ved farmakologisk at ændre neuron nære omgivelser med piggy-back multibarrel strømoder. Disse elektroder består af en enkelt tønde optagelse elektrode og en multibarrel stof elektrode, der kan bære op til 4 forskellige synaptiske agonister eller antagonister. De farmakologiske midler kan anvendes iontoforetisk på ønskede tidspunkter under forsøget, hvilket tillader tidsstyret levering og reversibel rekonfiguration af synaptiske input. Som sådan farmakologisk manipulation af mikromiljøet er en kraftfuld og enestående metode til at teste specifikke hypoteser om neural kredsløbsfunktion. Her beskriver vi, hvordan piggy-back elektroder er fremstillet, og hvordan de anvendes i in vivo forsøg. Den piggy-back system tillader en investigator at kombinere en enkelt tønde optagelse elektrode af enhver vilkårlig ejendom (modstand, tip størrelse, form osv.) med en multibarrel lægemiddel elektrode. Dette er en stor fordel i forhold til standard multi-elektroder, hvor alle tønder mere eller mindre har lignende former og egenskaber. Multibarrel electrodes blev først introduceret over 40 år siden 1-3, og har gennemgået en række konstruktionsmæssige forbedringer 2,3 indtil piggy-back type blev introduceret i 1980&#39;erne 4,5. Her præsenterer vi en række vigtige forbedringer i laboratoriet produktion af piggy-back elektroder, der giver mulighed for dyb indtrængning i hjernen i intakt in vivo dyr præparater på grund af en forholdsvis tynd elektrode aksel, der forårsager minimal skade. Endvidere disse elektroder karakteriseret ved lav støj optagelser, og har lav modstand lægemiddel tønder for meget effektiv iontoforese af de ønskede farmakologiske midler.

I dette eksperiment blev glycin-receptorantagonist stryknin-hydrochlorid iontophoretisk anvendelse. Blokering glycinergic inhibering typisk stiger fyring i neuroner. Figur 4 viser eksempler på data fra en auditiv neuron hvis reaktioner på sinusformede lydstimuli af stigende intensitet leveret til dyrets ører blev registreret. Denne type af et eksperiment benævnt neuron decharge rate vs intensitet funktion. Louder lyde resulterede i højere spike satser (sort kurve). Den indledende iontoforese strøm anvendes under dette forsøg var 15 nA. Efter den nuværende blev tændt og de ændringer i hastigheden intensitet funktionen havde stabiliseret sig på deres nye niveau (mørkeblå kurve), blev slynget ud strøm gradvist øges til 30, 45, og 60 nA (orange, grøn og lyseblå kurver, henholdsvis). I hvert tilfælde blev svarene fra neuron over det samme spektrum af lydstyrker registreret efter ændringer i dischaRGE rate-intensitet funktioner som reaktion på den nye udslyngning strøm havde stabiliseret. Den mest hensigtsmæssige udstødning strøm til brug i dette eksempel var 45 nA til 60 nA, fordi disse niveauer af strøm ikke længere ændre anderledes neuronet svar. Dette resultat viser, at ved 45 nA strøm, havde alle glycinreceptorer af denne neuron allerede blevet blokeret af stryknin-hydrochlorid. Enhver yderligere stigning i udstødningen nuværende og frigive endnu mere stryknin resulterede ikke i en yderligere ændring af neuron decharge rate-niveau funktionen. Efter afslutningen af ​​protokollen blev udslyngning strøm slukket. Genopretningen af ​​neurale reaktioner tilbage til baseline blev opnået efter ca 25 min (rød linje). Dette kan tage, afhængigt af typen og mængden af ​​lægemiddel skubbes ud, mellem nogle sekunder og flere gange ti minutter. <table border="1"><tbody><tr><td> Medicin </td><td> Koncentration </td><td> pH af en opløsning </td><td> Opløsningsmiddel </td><td> Firma </td><td> Kat. # </td><td> Typisk Retention Current </td><td> Typiske Ejection Currents </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> A-2129 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA til +100 nA </td></tr><tr><td> Glycin </td><td> 100 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> G-7126 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA til +100 nA </td></tr><tr><td> Bicucullin methiodid </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl i dH2O </td><td> Sigma </td><td> B-6889 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA til +60 nA </td></tr><tr><td> Stryknin hydrochlorid </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl i dH2O </td><td> Sigma </td><td> S-8753 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA til +80 nA </td></tr><tr><td> L-glutaminsyre </td><td> 500 mM </td><td> 8,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> G-1251 </td><td> 30 nA </td><td> -10 NA til -150 nA </td></tr><tr><td> L-asparaginsyre </td><td> 500 mM </td><td> 8,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> A-8949 </td><td> 30 nA </td><td> -10 NA til -150 nA </td></tr><tr><td> Kaininsyre </td><td> 1 mM </td><td> 9,0 </td><td> dH2O </td><td> Sigma </td><td> K-0250 </td><td> 30 nA </td><td> -10nA til -100 nA </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Almindeligt anvendte lægemidler, med pH til opløsning og koncentrering. Tabellen viser de mest almindeligt anvendte synaptiske agonister og antagonister anvendes med iontoforese. PH miljø opført regnskaber for behovet for at polarisere t<html> isse midler og de foreslåede koncentrationsgrænser regnskab for variabiliteten i effektivitet mellem forskellige lægemidler. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> Figur 1. Tre multibarrel pipetter med forskellige tip længder A:. Spidsen af denne 5-tønde elektrode er blevet trukket for lang og tynd. Bemærk, at spidsen er bøjet og meget blødt. Denne type spidsen er meget vanskeligt at bryde til den ønskede diameter. B: Spidsen af ​​denne elektrode er for kort og stumpet. Når frem til dybere områder i hjernen, vil denne elektrode forårsage unødig hjerneskade som følge af, at elektroden bliver relativt tyk kun få millimeter efter spidsen. C: Et eksempel på en elektrode med en korrekt trukket spids. Samtidig være lang og tynd, spids stadig er fast og kan brydes let til den ønskede tip diameter. guren 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Tegning af elektrode manipulator samlingen. Manipulatoren enhed anvendes sammen med et mikroskop at samle piggy-back elektroder. Elementer markeret med gråt er kommercielt tilgængelige produkter og er anført i tabel 2. Elementer markeret med blåt blev skik bearbejdet på vores institutions maskinværksted. De er 1) 1/4 tommer stålplade størrelse 43x26 cm med huller til Newport etape 423 boret ind i det i henhold til hulmønsteret fra Newport, 2) en vippe scene, der giver mulighed for vipning af samlingen på vilkårlige vinkler, 3) en stik, der monterer elektrodeholderen til toppen translationel fase. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> Figur 3. Billede af en prøve piggy-back elektrode. En færdig 5-tønde elektrode samles sammen med en enkelt-cylinder optagelse electrode. Bemærk langskaftet på ca 7mm giver mulighed for en dyb hjerne optagelser. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> Figur 4. Titrering af ejektion strømme. Grafen viser rate-intensitet funktioner optaget fra en enkelt auditiv neuron, mens dyrets ører blev stimuleret med toner af forskellige intensiteter. Kraftigere lyde plejer at fremkalde højere fyring rates. Før Drug Application viste neuron kurs-intensitet funktion de laveste spike satser (sort kurve). Gradvist højere ejektionsprocesser strømme blokeret gradvis flere glycinreceptorer på neuron, hvilket resulterer i progressivt højere fyring satser. Den optimale udstødning strøm i dette neuron var 45-60 nA. Med disse udstødning strømme, blev fuldstændig blokering af alle neuron s glycinreceptorer opnået. Efter afslutning af den eksperimentelle protokol blev iontoforese afbrudt, og neuron lodesfode igen. Fuldstændig helbredelse blev opnået, når genfindingsprocenten-intensitet funktion matchede den indledende præ-lægemiddel recovery funktion. Gengivet med tilladelse fra American Physiological Society, fra Klug et al, 1995.

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses at JoVE.com

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontoforese af neurale agonister og antagonister under ekstracellulært<em&gt; In vivo</em&gt; Optagelser er en effektiv måde at manipulere en neuron er mikromiljø. Disse manipulationer kan lettest ske via piggy-back multibarrel elektroder. Her beskriver vi, hvordan at fremstille dem og bruge dem i løbet auditive optagelser.

Produktion og brug af Piggy-back Multibarrel Elektroder for<em&gt; In vivo</em&gt; Farmakologiske Manipulationer af neurale Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning af Microregional Hypoxia i mus hjernebarken ved to-foton Imaging af endogent NADH Fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Kirurgisk implantation af Kroniske Neurale elektroder til Optagelse Single Unit Aktivitet og Electrocorticographic signaler

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Udarbejdelse af en vågen Mouse til optagelse Neurale svarene og Injektion Lysspor

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

Metode til Systematic Elektrokemisk og Elektrofysiologiske Evaluering af Neural Recording elektroder

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...