Name: manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door R01 DC 011582 (AK) en RO1 DC011555 (DJT).

<ol><li> Trek glaselektroden Trek glaselektroden <ol><li> Trek single barrel elektrode. Gebruik enkele vat glazen capillaire voor gloeilampen en fooi tot een diameter van ongeveer 1-2 micrometer, schachtlengte van 10-12 mm, en de bijbehorende elektrode weerstand van ongeveer 12 MOhm (bereik van 5-20 MOhms) te trekken, zoals gemeten in 0,9% NaCl-oplossing. Onderste elektrode weerstanden zou resulteren in meer achtergrond activiteit en dus meer moeite met het isoleren unitaire activiteit van individuele neuronen. Voor het trekken deze elektrode, gebruikt u een horizontale of een verticale trekker met ofwel verwarming filamenten of verwarmingsspiralen. </li><li> Trek multibarrel elektrode. Door de veel grotere diameter van multibarrel glas en de noodzaak van een gelijkmatige warmteverdeling over de gehele multibarrel wordt een krachtige trekker met een grotere diameter verwarmingselement geen verwarming filament, nodig. Een multibarrel pipet moet worden ingebracht in het midden van de verwarming met n filamento contact opnemen met het verwarmingselement. Merk op dat naast de 5-cilinder pipetten hier beschreven, 3-barrel of 7-vat pipetten zijn commercieel beschikbare alternatieven. Trek glas een pipetpunt van ongeveer 10 micrometer totale diameter of minder. De tip wordt verbroken om de juiste diameter in de volgende stap, zodat het precieze punt kleiner is kritisch bij het trekproces dan de algehele vorm van de elektrode, die moet lang en relatief dun. Zie de afbeelding in figuur 1C voor de gewenste elektrode vorm. Korte en stompe elektrode vormen (figuur 1B) zal een aanzienlijke hoeveelheid weefselschade wanneer voortbewogen in de hersenen, terwijl zeer lange en dunne elektrode vormen (Figuur 1A) kan dus buigen en bemoeilijken de elektrode op de juiste breken diameter (zie stap 2). </li></ol></li><li> Wijzig Elektrode Tips Wijzig elektrode tips. Voordat de twee elektroden worden gelijmdZij moeten worden aangepast. De as van de interne elektrode moet worden gebogen voordat het kan worden bevestigd aan de multibarrel te zorgen dat de gecombineerde as van de afgewerkte piggy-back elektrode zo dun mogelijk. Bovendien, de punt van de elektrode multibarrel moet worden afgebroken om lage weerstand te garanderen voor iontoforese. <ol><li> Buig as van een vat elektrode ongeveer 20 graden. De kleinst Bunsen brander vlam mogelijk. Typische &quot;kleine&quot; Bunsenbranders van standaard lab toeleverende bedrijven te creëren vlam maten die zijn veel te groot voor deze toepassing. Om dit probleem te omzeilen gebruik maken van de kleinste commerciële bunsenbrander en zet een injectienaald (~ 18 gauge) naar de top van de brander, en sluit de verbinding met behulp van tandheelkundig cement. Bij gebruik, de vlam moeilijk te zien, ongeveer 5 mm of minder in diameter en ongeveer 8 mm lang. Elke beweging van de lucht in de kamer zal doven die vlam, dus het is een goed idee om de brander te werken in eenafgesloten ruimte, of om windschermen te gebruiken. Verplaats de enkel vat elektrode door de vlam te buigen met ongeveer 20 graden. Doel om de vlam van de brander het glas smelten bij de overgang op ongeveer 10 millimeter afstand van de punt van de elektrode. Om te voorkomen dat het smelten van de punt van de elektrode stellen we voor dat de elektrode worden gehouden op ongeveer 45 graden, punt naar beneden en verplaats de elektrode door de vlam relatief snel. </li><li> Breek het topje van de multibarrel elektrode. Om visuele controle te waarborgen, terwijl het breken van de elektrode, een microscoop met een minimum 10x objectief en 10x oculairs. Een meetschaal ingevoegd in het oculair zal ook nodig zijn om tipformaten te meten. Bevestig een plexiglas de microscoop zodanig dat het einde van het plexiglas te zien in ongeveer een derde tot de helft van het gezichtsveld van de microscoop. In ons geval, het plexiglas stuk is ongeveer 25 x 70 mm en 5 mm dik en bevestigd via een schroef die kan worden vastgezet in een op maatgemaakt draad in de microscoop podium. Het is belangrijk om een ​​ontwerp dat zorgt voor het plexiglas bewegen onafhankelijk van de dia. Plaats de multibarrel elektrode in een bed van boetseerklei op een glasplaatje, en plaats de dia met de elektrode in schuif de microscoop podium van de houder. Met behulp van xy de microscoop stadium van de manipulators, beweeg de punt van de elektrode tegen het plexiglas stuk, en observeer het breken van de punt door de microscoop oculairs. Probeer netjes breken multibarrel de tip om een ​​cumulatieve diameter van ongeveer 25-35 micrometer. Gooi pipetten met tip diameters die brak af te groot, of tips met ongelijke pauzes. We verwerpen ongeveer 30% van onze multibarrel elektroden te wijten aan ongewenste tip vormen. </li></ol></li><li> Monteer Piggy-back Electrode Monteer piggy-back elektrode. <ol><li> Plaats elektroden. Verwijder plexiglas stuk gebruikt in stap 2.2 van de microscoop podium. Zet voltooidmultibarrel elektrode in boetseerklei op een glasplaatje, tip iets omhoog wijzend. Naar boven gericht is van belang voor stap 3.2, het lijmen van de twee elektroden. Tips die omhoog wijzen waardoor de lijm om weg te lopen van de punt, het vermijden van het lijmen van de elektrode tips. Plaats gebogen single barrel elektrode in elektrode houder van de op maat gemaakte micromanipulator (figuur 2). Met behulp van visuele begeleiding en daarna microscopisch begeleiding, laat de single barrel elektrode op de multibarrel elektrode. De enkele elektrode moet rechtstreeks worden neergelaten in de groef die is gevormd door de opstelling van de 5 vaten, met de punt uitstekende het uiteinde van de tip multibarrel van ongeveer 5-10 micrometer. Bij verlaging van de enkel vat, observeren de hoek die wordt gevormd tussen de twee elektroden. De beste resultaten vermijden hoeken waarbij de tips apart wijzen van elkaar, maar probeert de enkele elektrode lager in de multi perfect parallel of met de punthet aanraken van de multibarrel eerste, de vorming van een zeer lichte &#39;wig&#39; arrangement. Aangezien het enkele vat tip is zeer flexibel, zal buigen wanneer de interne elektrode iets verder verlaagd nadat de punt heeft bereikt bovenoppervlak van de multi vat elektrode, waardoor een schoon samengestelde tip een kleine hoeveelheid veerwerking is ingebouwd waarmee die de tips elkaar. Indien echter de hoek tussen een vat en multibarrel elektrode te steil (te grote wig), zal de veerwerking te hoog en buig de elektrodeopstelling beneden. </li><li> Lijm elektrode assen samen. Lijm de assen van de twee elektroden aan elkaar met behulp van cyanoacrylaat (secondenlijm). Plaats een kleine druppel lijm op de kleine kant van een platte tandenstoker en contact elektrode assemblage met de lijm druppel. Begin bij de positie meest distaal van de tips en langzaam tandenstoker te gaan met lijm druppel langs elektrode schachten naar de elektrode tips. Het gebruik van te veel lijm of het aanbrengen van lijm too dicht bij de elektrodetoppen resulteert in lijmen de elektrode openingen, waardoor de elektrode tenminste gedeeltelijk functioneel. </li><li> Stabiliseren gewricht met tandheelkundig cement. Meng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement en tandheelkundige acryl in een kleine wegwerp plastic schotel of boot, wegen met een platte tandenstoker. Wacht tot cement wordt vormbaar en breng een kleine hoeveelheid aan op de verbinding tussen de twee elektroden aan de gezamenlijke (roze materiaal in figuur 3) te stabiliseren. Laat ongeveer 15 minuten om te drogen. </li><li> Verwijder en bewaar elektrode. Verwijder voorzichtig de ingevulde piggy-back elektrode eerst uit de micromanipulator houder, en dan los van het glaasje, en op te slaan in een stofvrije container. </li></ol></li><li> Bereid Elektrode Fill Solutions Bereid electrode fill oplossingen. Aangezien iontoforese is geladen moleculen, de meeste subjecten hetzij opgelost in een zuur of alkalisch milieu (typisch eenta pH van 3-4, of een pH van ongeveer 8-10, respectievelijk). Een aantal chemische stoffen die vaak worden gebruikt in iontoforese zijn vermeld in tabel 1. Voor middelen die niet zijn opgenomen in de tabel bepalen van de pKa waarde of het gemakkelijker om de molecule te gebruiken in een zuur of alkalisch milieu om de molecule geladen en lossen daarvan. Voor de beste resultaten, dagelijkse meng alle oplossingen fris. </li><li> Vul en Bereid elektroden Vul en voor te bereiden elektroden. Vlak voor het gebruik van de elektrode, back-vul elk vat met zijn respectievelijke geneesmiddel, met behulp van koolstofvezel 28 tot 34 gauge naalden aan spuiten met spuit filters. Vul de 4 buitenste vaten van de 5-cilinder configuratie met de drugs van keuze, en het centrum vat met 3M NaCl als een evenwichtsoefening vat. Vul de single barrel registratie-elektrode met 3M NaCl ook. Toevoegen van een kleurstof aan de NaCl oplossing, zoals fast green of fenolrood maakt het gemakkelijker om de elektrode geschikteTijdens plaatsing van de elektrode op de hersenoppervlakte. Plaats de elektrode in de elektrode houder van de opname-instellingen en steek alle draden in de daarvoor bestemde glas vaten. Gebruik geïsoleerde zilverdraad waar ongeveer 1 cm isolatie is verwijderd aan het uiteinde. Zijn 5 draden voor de multibarrel elektrode (4 drug vaten en een evenwicht barrel), plus de versterker draad die moet worden opgenomen in de opname enkele vat elektrode. </li><li> Zet Iontoforese Pomp Modules Schakel iontoforese pomp modules en test alle vaten. De elektrode testfunctie van elke pomp module te bepalen of de elektrode vat functioneel. Om lekkage van de drugs de vaten voorkomen wanneer niet in gebruik, een retentie spanning in de tegengestelde polariteit als de molecule heffing te worden toegepast. </li></ol>

<ol>
	<li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assembly+of+"parallel"+micro-pipettes.">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li><li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel.">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li><li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra.">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li><li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+constructing+"piggy-back"+multibarrel+microelectrodes.">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li><li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes.">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li><li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes.">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li><li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons:+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input.">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus.">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus:+implications+for+encoding+sound+location.">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li><li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus.">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li><li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus.">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li><li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus:+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation.">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124 (2001).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus.">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus.">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li><li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons:+iontophoretic+studies.">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li><li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons.">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li><li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus.">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li><li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus.">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li><li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat.">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li><li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons.">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li><li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus:+facilitated+combination-sensitive+neurons.">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li><li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons.">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li><li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats.">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li><li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus.">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li><li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus.">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschrijven een techniek die het mogelijk maakt de manipulatie van microschakeling een neuron in vivo, terwijl tijd die de opname van het neuron antwoorden tijdens de experimentele manipulatie. Neurale circuits worden gemanipuleerd via de iontophoretical toepassing van synaptische agonisten en antagonisten. Het belangrijkste voordeel van iontoforese overdruk ejectie dat iontoforese vereist niet de fysieke verplaatsing van vloeistof uit de elektrode in zenuwweefsel en dus is er geen zorg veroorzaken weefselbeschadiging door de uitgeoefende druk of vloeistofvolume. De belangrijkste beperking van deze techniek is het gebrek aan informatie over de absolute geneesmiddelconcentratie in het weefsel en het volume van weefsel beïnvloed. Aangezien de hoeveelheid van farmacologische middelen uitgeworpen met iontoforese zijn veel kleiner en meer nauwkeurig regelbare druk dan bij uitwerping, het herstel van het geneesmiddel toepassing doorgaans veel sneller eend veel vollediger. Microiontophoresis is met succes toegepast in een aantal neurale systemen, sensorische en anderen, en is het meest succesvol toegepast in hersengebieden met weinig of geen intrinsieke verwerking. De reden is dat sommige van de uitgevoerde farmacologische middel kan de applicatieplek diffunderen naar een aangrenzende neuron en manipuleer de responseigenschappen van de naburige neuron. De afzonderlijke fabricage van enkelvoudige en meervoudige elektroden barrel maakt de combinatie van elektroden met willekeurige en onafhankelijke eigenschappen. Electrode trekken samen en vaten met een voor opname en een voor iontoforese doeleinden zou opleveren elektrodetoppen met vergelijkbare eigenschappen, zodanig dat de elektrodetoppen ofwel te groot zou zijn voor een cel opnemen of te klein voor toepassing drug. Ook, na de single barrel tip buiten de multibarrel elektrodetoppen uit te breiden met ongeveer 20 micrometer sterk vermindert ruis in de opnames, eend elimineert mogelijke verstorende huidige effecten van de het behoud of het uitwerpen stromen op het afvuren van de neuron&#39;s 3. Piggy-back multibarrel elektroden eerst zijn beschreven 30 jaar geleden 4-6 en zijn zeer succesvol gebruikt om neurale circuits 7-18 19-29 ontleden. Aldus maakt de werkwijze op zich niet nieuw is of uniek. Echter, de specifieke details van de elektrode bereiding en het gebruik gewijzigd loop der jaren en de reeks instructies hier beschreven is gebleken bijzonder eenvoudig en succesvol, en is niet gepubliceerd in detail elders in de literatuur. Vooral het buigen van de enkel vat elektrode kan de laatste tip van de piggy-back elektrode relatief slank (figuur 3) en daarmee zorgt voor opnamen van diepe kernen met minimale schade aan de hersenen, de uitstekende van de enkel vat elektrode op de multi-barrel elektrode verwijdert vrijwel alle valutat effecten die vaak genoemd als een nadeel van de techniek 3. Nieuwe details hier gepresenteerde zoals het hebben van de elektrode punt naar boven tijdens het lijmen proces en rust de single barrel in de groef van de multibarrel elektrode zal een hoog slagingspercentage te garanderen bij de productie van piggy-back elektroden. De techniek is relatief eenvoudig en kan meestal worden beheerst door een beginner binnen een paar dagen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het item </td><td> Fabrikant </td><td> Commentaar </td><td> Cat. # </td></tr><tr><td> Bunsenbrander </td><td></td><td> Beschikbaar vanaf: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> Twee-componenten tandheelkundig cement: &quot;Cold cure&quot; tandmateriaal </td><td> Co-oraal-ite Dental Mfg Co </td><td> Beschikbaar vanaf: AM Systems, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Twee-componenten tandheelkundig cement: Gebit materiaal verknoping vloeibaar preparaat </td><td> Co-oraal-ite Dental Mfg Co </td><td> Beschikbaar vanaf: AM Systems, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Vloeibare lijm </td><td> Henkel </td><td> Beschikbaar vanaf: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> Micro-Iontoforese Unit: BH-2 Neurophore </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Beschikbaar vanaf: Harvard Apparatus </td><td> 65-0.200 &amp; 65-0203 </td></tr><tr><td> Geïsoleerde zilverdraad </td><td> AM-Systems </td><td> Beschikbaar vanaf: AM-Systems </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> Horizontale trekker </td><td> Zeitz DMZ-Universal Puller </td><td> Beschikbaar vanaf: AutoMate Wetenschappelijk </td><td> NA </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: elektrodehouder </td><td> WPI </td><td> Beschikbaar vanaf: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: lineaire fase </td><td> Newport 423 Series </td><td> Beschikbaar vanaf: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: rotatie fase </td><td> Newport RSP-2 </td><td> Beschikbaar vanaf:Newport </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: z vertaling </td><td> Newport 433 Series </td><td> Beschikbaar vanaf: Newport </td><td> 433 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: hoekbeugel 90 ° tot z en xy-as monteren </td><td> Newport 360-90 </td><td> Beschikbaar vanaf: Newport </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stuks: x vertaling / lineaire fase </td><td> Newport 423 Series </td><td> Beschikbaar vanaf: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipulator stukken: y vertaling / lineaire fase </td><td> Newport 423 </td><td> Beschikbaar vanaf: Serie Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Leitz Laborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> Microscoop: objectieve </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> Microscoop: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, PERIPLAN 10x/18 </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> Microscoop: stage </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel capillair </td><td> N / A </td><td> Beschikbaar vanaf: AM-systemen, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> Sinlge vat capillair (GC 150F-10) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Beschikbaar vanaf: Harvard Apparatus </td><td> 30 tot 0057 </td></tr><tr><td> Verticale trekker </td><td> Narishige model PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Custom made elementen van de Micro-manipulator (gemarkeerd licht blue in figuur 1) </td><td></td></tr><tr><td> stalen plaat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kantelen basis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> bevestiging voor elektrodehouder </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tabel 2. Producenten en onderdeel nummers van alle apparatuur en benodigdheden die in de procedure. </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

In vivo opnames van enkele neuronen waardoor een onderzoeker het afvuren van neuronen eigenschappen, bijvoorbeeld onderzocht in reactie op sensorische stimuli. Neuronen meestal krijgen meerdere exciterende en inhiberende afferente en / of efferente input die integreren met elkaar, en de uiteindelijke gemeten respons eigenschappen van het neuron worden gedreven door de neurale integraties van deze ingangen. Studeren informatieverwerking in neurale systemen, is het noodzakelijk de verschillende ingangen begrijpen een neuron of neurale systeem en de specifieke eigenschappen van deze ingangen. Een krachtige en technisch relatief eenvoudige methode om de functionele rol van bepaalde grondstoffen die een bepaalde neuron ontvangt beoordelen is dynamisch en reversibel te onderdrukken of te elimineren deze ingangen, en de veranderingen in de output van de neuron, veroorzaakt door deze manipulatie te meten. Dit kan worden bereikt door het veranderen van de farmacologisch neuron de directe omgeving met piggy-back multibarrel electrodes. Deze elektroden bestaan ​​uit een enkel vat registratie-elektrode en een elektrode die multibarrel drug kan tot 4 verschillende synaptische agonisten of antagonisten. De farmacologische middelen kunnen worden toegepast iontoforetisch gewenste tijdstippen gedurende het experiment, waardoor tijd gecontroleerde aflevering en omkeerbare herconfiguratie van synaptische inputs. Als zodanig, farmacologische manipulatie van de micro-omgeving is een krachtige en ongeëvenaarde methode om specifieke hypothesen te toetsen over neurale circuit functie. Hier beschrijven we hoe piggy-back elektroden zijn vervaardigd, en hoe ze worden gebruikt tijdens in vivo experimenten. De piggy-back systeem maakt het mogelijk een onderzoeker aan een enkele vat registratie-elektrode van een willekeurige woning (weerstand, tip grootte, vorm enz.) te combineren met een multibarrel drug elektrode. Dit is een belangrijk voordeel boven standaard multi-elektroden, waarbij alle vaten min of meer vergelijkbare vormen en eigenschappen. Multibarrel electrodes werden voor het eerst meer dan 40 jaar geleden een tot drie geïntroduceerd, en zijn onderworpen aan een aantal verbeteringen in het ontwerp 2,3 tot de piggy-back-type werd geïntroduceerd in de jaren 1980 4,5. Hier bevat een aantal belangrijke verbeteringen in het laboratorium productie van piggy-back elektroden voor diepe hersenpenetratie mogelijk intact in in vivo dierlijke preparaten door een relatief dunne elektrodeschacht dat minimale schade veroorzaakt. Verder worden deze elektroden worden gekenmerkt door lage ruis opnames en een lage weerstand drug vaten zeer effectieve iontoforese de gewenste farmacologische middelen.

In dit experiment werd de glycine receptor antagonist strychnine hydrochloride iontoforetisch toegepast. Het blokkeren van glycinergic remming meestal verhoogt vuren in neuronen. Figuur 4 toont voorbeeldgegevens uit een auditieve neuron wiens reacties op sinusvormige geluid stimuli van toenemende intensiteit geleverd aan de oren van het dier werden geregistreerd. Dit type experiment wordt aangeduid als de neuron debiet vs intensiteit functie. Luider geluid resulteerde in een hogere piek tarieven (zwarte curve). De eerste iontoforese huidige gebruikt tijdens dit experiment was 15 nA. Nadat de stroom werd ingeschakeld en de veranderingen in de snelheid intensiteit functie had gestabiliseerd op hun nieuw niveau (donker blauwe curve), werd het uitwerpen huidige geleidelijk verhoogd tot 30, 45, en 60 nA (oranje, groen en lichtblauw bochten, respectievelijk). In elk geval werden de reacties van de neuron over hetzelfde bereik van geluid intensiteiten opgenomen na de veranderingen in de discharge lage intensiteit functies in reactie op de nieuwe uitwerpen huidige was gestabiliseerd. De meest geschikte uitwerpen stroom gebruikt in dit voorbeeld was 45 nA tot 60 nA omdat deze niveaus van stroom niet anders veranderen de neuron antwoorden. Dit resultaat suggereert dat bij 45 nA stroom, alle glycine receptoren die neuron reeds geblokkeerd door strychnine hydrochloride. Een verdere toename van de uitwerpbeugel vrij lopende en nog strychnine resulteerde niet in een verdere verandering van de ontlading neuron lage niveau functie. Na de voltooiing van het protocol, werd het uitwerpen huidige uitgeschakeld. Het herstel van neurale responsies terug naar de uitgangswaarde werd bereikt na ongeveer 25 min. (rode lijn). Kan aannemen afhankelijk van het type en de hoeveelheid geneesmiddel uitgeworpen, tussen enkele seconden tot enkele tientallen minuten. <table border="1"><tbody><tr><td> Drug </td><td> Concentratie </td><td> pH van een oplossing </td><td> Solvent </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. # </td><td> Typische Retentie Actueel </td><td> Typische Ejection Currents </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-2129 </td><td> -15 NA </td><td> +5 NA tot +100 nA </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 100 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-7126 </td><td> -15 NA </td><td> +5 NA tot +100 nA </td></tr><tr><td> Bicuculline methiodide </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl in dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> B-6889 </td><td> -15 NA </td><td> +5 NA tot +60 nA </td></tr><tr><td> Strychnine hydrochloride </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl in dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> S-8753 </td><td> -15 NA </td><td> +5 NA tot +80 nA </td></tr><tr><td> L-Glutaminezuur </td><td> 500 mM </td><td> 8,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-1251 </td><td> +30 NA </td><td> -10 Tot -150 nA nA </td></tr><tr><td> L-asparaginezuur </td><td> 500 mM </td><td> 8,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-8949 </td><td> +30 NA </td><td> -10 Tot -150 nA nA </td></tr><tr><td> Kainzuur </td><td> 1 mM </td><td> 9,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> K-0250 </td><td> +30 NA </td><td> -10nA tot -100 nA </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Gebruikte geneesmiddelen met pH voor het oplossen en concentratie. De tabel toont de meest gebruikte synaptische agonisten en antagonisten gebruikt iontoforese. De pH milieu vermeld vertegenwoordigt de noodzaak t polariseren<html> eze middelen, en de voorgestelde concentratie verklaart de variabiliteit in effectiviteit tussen verschillende drugs. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> Figuur 1. Drie multibarrel pipetten met verschillende lengtes tip A:. De tip van deze 5-vat elektrode is getrokken te lang en dun. Merk op dat de tip is gebogen en zeer zacht. Dit type tip zeer moeilijk te breken om de gewenste diameter. B: De tip van deze elektrode is te kort en gedrongen. Wanneer voortbewogen in diepere hersengebieden wordt deze elektrode onnodig hersenbeschadiging door het feit dat de elektrode wordt relatief dikke enkele millimeters na de tip. C: Een voorbeeld van een elektrode met een correct getrokken tip. Terwijl ze lang en dun, de punt nog stevig en kan gemakkelijk worden tot het gewenste tip diameter. guur 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Tekening van de elektrode manipulator montage. De manipulator assemblage wordt gebruikt in combinatie met een microscoop naar de piggy-back elektroden monteren. Items die in het grijs zijn commercieel verkrijgbare producten en zijn opgesomd in Tabel 2. Items gemarkeerd in het blauw werden op maat bewerkt op machine van onze instelling winkel. Ze zijn 1) 1/4 inch staalplaat formaat 43x26 cm met gaten voor Newport fase 423 geboord in het volgens het gatenpatroon door Newport, 2) een kantelbaar fase waardoor voor het kantelen van de apparatuur in willekeurige hoeken, 3) een connector die de elektrodehouder mounts naar de top translationele fase. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> Figuur 3. Foto van een monster piggy-back elektrode. Een afgewerkt 5-vat elektrode gemonteerd samen met een vat opname electrode. Let op lange schacht van ongeveer 7mm waardoor een diepe hersenstimulatie opnamen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> Figuur 4. Titratie van wegschietende stromen. De grafiek toont tarief-intensiteit functies zijn opgenomen van een enkele auditieve neuron terwijl het dier de oren werden gestimuleerd met tonen van verschillende intensiteiten. Luider geluid de neiging om hogere afvuren tarieven te lokken. Voordat Drug Application, het neuron het tarief-intensiteit functie toonde de laagste piek tarieven (zwarte curve). Steeds hogere uitworp stromen steeds meer glycine receptoren geblokkeerd op het neuron, wat resulteert in steeds hogere vuren tarieven. De optimale uitwerpen stroom in deze neuron was 45-60 nA. Met deze uitwerpen stromen werd volledige blokkering van de neuron glycine receptoren bereikt. Na voltooiing van de experimentele protocol werd het iontoforese beëindigd en de neuron lietherstellen. Werd volledig herstel bereikt wanneer de recovery rate-intensiteit functie overeen met de eerste pre-drug recovery functie. Gereproduceerd, met toestemming van de American Physiological Society, van Klug et al., 1995.

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses at JoVE.com

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontoforese van neurale agonisten en antagonisten tijdens extracellulaire<em&gt; In vivo</em&gt; Opnames is een krachtige manier om een ​​neuron de micro-omgeving te manipuleren. Deze manipulaties kan heel eenvoudig worden gedaan via piggy-back multibarrel elektroden. Hier beschrijven we hoe ze te produceren en te gebruiken tijdens auditieve opnamen.

Productie en gebruik van Piggy-back Multibarrel Elektroden voor<em&gt; In vivo</em&gt; Farmacologische Manipulaties van neurale responsies

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

De combinatie van Behavioral Endocrinologie en Experimentele Economie: Testosteron en Sociaal Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Chirurgische Implantatie van chronische neurale elektroden voor opname Single Unit Activiteit en electrocorticografische signalen

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Voorbereiding van een Awake Muis voor opnemen Neurale Reacties en injecteren van Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Ontwerp en Montage van een Ultra-light Gemotoriseerde Microdrive voor Chronische Neurale Opnamen in Kleine Dieren

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

Een methode voor het systematisch Elektrochemische en elektrofysiologische evaluatie van neurale registrerende elektroden

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...