Name: a novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants at JoVE.com

Agradecemos Erika Mileti para excelente suporte técnico e Dr. Antonio Di Sabatino para fornecer as câmaras de oxigênio. Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações do sétimo programa-quadro da UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fundação Cariplo para MR e suporte por um Curie rede de mobilidade internacional de formação Marie (Cross-Talk, subvenção No: 21553-2) para KT.

1. Obtenção e Preparação do tecido <ol><li> Tissue (saudável ou IBD mucosa) é obtido durante a cirurgia. Quando a amostra é excisada transferência para o laboratório, logo que possível, mantendo-o em Ca + + / Mg + + tampão HBSS suplementado com Pen / Strep a 4 ° C ou sobre gelo. </li></ol> * O tamanho da amostra depende da disponibilidade do tecido: a parte do tecido obtido, é que não é estritamente necessária para o diagnóstico e pode variar bastante entr...

<ol>
	<li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection.">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li><li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models?.">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?.</a> Gut Microbes. , (2012).</li><li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems:+prediction+for+in+vivo+efficacy.">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056 (2009).</li><li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review.">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).</li><li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis.">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine.">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li><li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis:+a+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li><li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria.">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).</li></ol>

A necessidade de modelos fisiologicamente relevantes em que os tratamentos para mucosa intestinal humana pode ser validamente testados tem sido enfatizada. Muitos pesquisadores têm identificado potenciais artefatos e defeitos tanto na célula 5 e 6 modelos de mouse usado até agora para esse fim. Na verdade, mesmo que os dados pré-clínicos promissores é muitas vezes obtido, estes raramente se traduzem em benefícios clínicos significativos. O método descrito neste...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Regeant</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog No.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X HBSS</td>
			<td>Eurocalne</td>
			<td>ECM4006XL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peni/Strepto</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17602E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12614</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X ITS-X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>100-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17605E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyr</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 6x8 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-00608</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 8x8 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-0080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 10x10 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-01010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td>Home made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centre well organ culture plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue (Vetbond)</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Jars</td>
			<td>Home made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks</td>
			<td>Air Liquid Sanit&agrave;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants

Existem poucos modelos atualmente para simular realisticamente micro-ambiente do complexo do intestino humano, onde uma variedade de interações ocorrem. Homeostase adequada depende directamente estas interacções, visto que todo modelar uma resposta imunológica induzir tolerância contra os antigénios dos alimentos, enquanto ao mesmo tempo de montagem respostas imunes eficazes contra micróbios patogénicos acidentalmente ingeridas com alimentos. Homeostase intestinal também é preservada através de várias interacções complexas entre a microbiota (incluindo as estirpes bacterianas benéficas associadas ao alimento) e do hospedeiro, que regulam a fixação / degradação do muco, da produção dos péptidos antimicrobianos, através da barreira epitelial, e a &quot;formação&quot; do células epiteliais &quot;, que controla o fenótipo tolerogenic ou imunogênica de únicas, gut-residentes células linfóides das populações. Estas interacções têm sido muito difíceis de reproduzir com ensaios in vitroutilizando quer linhas de células cultivadas ou de células mononucleares do sangue periférico. Além disso, os modelos de rato diferem substancialmente em componentes da mucosa intestinal (organização da camada de muco, a comunidade de bactérias comensais) com respeito ao intestino humano. Assim, os estudos de uma grande variedade de tratamentos para ser interpostos nas clínicas para as condições relacionadas com o stress ou patológicos importantes, tais como a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino ou o cancro colo-rectal têm sido difíceis de realizar. Para tratar dessas questões, foi desenvolvido um novo sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana, que mantêm o seu in situ condicionado pela microbiota de acolhimento e resposta imune, de forma polarizada. Estimulação apical polarizada é de grande importância para o resultado da resposta imunitária induzida. Tem sido repetidamente demonstrado que os mesmos estímulos podem produzir respostas completamente diferentes quando ignorar a cara apical do epi intestinalthelium, estimulando as células epiteliais basolateralmente ou entrar em contato direto com os componentes da lâmina própria, mudando o fenótipo de tolerogenic para imunogênica e causando inflamação excessiva e desnecessária na área. Conseguimos estimulação polarizada por colagem de um cilindro caverna que a área delimitada da estimulação na cara apical da mucosa, como será descrito no protocolo. Nós usamos este modelo para examinar, entre outros, os efeitos diferenciais de três estirpes diferentes de bactérias lácticas. Mostramos que este modelo de sistema é muito poderoso para avaliar as propriedades imunomoduladoras de probióticos em condições saudáveis ​​e doença.

Conseguimos manter a mucosa intestinal humana saudável e IBD em cultura por pelo menos 24 horas preservando o bem-estar do tecido. Em conformidade com as observações anteriores 1, isto foi apenas possível se a maior parte do tempo de cultura (de pelo menos 85% do total) foi realizada em O 2, tal como o tecido não sobreviveram durante 24 horas em incubadoras convencionais (Figura 2). Mostramos também que as diferentes respostas de explantes pode ser observado neste modelo, dep...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants at JoVE.com

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Introduzimos um novo método para a manutenção da mucosa intestinal humana em cultura e monitorização da resposta a vários tipos de estímulos durante pelo menos 24 horas. Com o nosso método, a polaridade do tecido é mantida, o que permite um estímulo fisiológico por via apical.

Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Um modelo ex vivo da cultura do tecido da cartilagem que remodela em explants bovinos do joelho

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...