Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

نشكر الدكتور جون هايز تكرمت للمخطوطات؛ الدكاترة. اريك برادلي وكريستوفر ديل نيجرو للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر؛ درو هيوز، لورا Odorizzi، Garafalo اليكس، Lowden ريبيكا، وليز ماكموراي على عملهم في تطوير المشروع وتوفير البيانات الأولية، والدكتور جريج سميث للحصول على اقتراحات مفيدة على التحليل الإحصائي. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (NINDS IR15N5067566-01) إلى MSS ومعهد هوارد هيوز الطبي العلوم منحة التعليم في كلية وليام وماري.

يتم تنفيذ جميع التجارب التالية البروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام في كلية وليام وماري. مراحل نمو المشار إليها في هذا البروتوكول، وفقا لفابر وNieuwkoop 46. 1. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li sty...

مع أنواعه الخلية جيدا أن تتميز من الحفظ في جميع الفقاريات، وشبكية العين يوفر نموذجا مفيدا لدراسة العمليات الجزيئية الخلوية التي تنظم خلية مواصفات نوع والتمايز. زراعة الخلايا الأولية تتيح وسيلة قوية للتحقيق في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك التعبير الجيني، ودي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> لتشريح والتثقيف </td></tr><tr><td> BD الصقر الأنسجة أطباق سهلة قبضة الثقافة، 35 مم </td><td> الصياد </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> المتاح أطباق بتري البوليستيرين، 60 × 15 مم </td><td> الصياد </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 مم السطح Nunclon أطباق بتري (مع Airvent) </td><td> الصياد </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> دومون الجميلة الملقط (Dumostar # 55) </td><td> الصياد </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice الصغرى، حكمت ساترة من البلاستيك، 25 مم </td><td> الصياد </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيل-M-أمينوبنزوات Methanesulfonate الملح (MS-222) </td><td> MP Biomedicals، LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> جنتاميسين سلفات </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco التربسين (1:250) مسحوق </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز نسج كلوستريديوم B من </td><td> روش </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> النيل الأزرق كبريتات (اختياري) </td><td> Pfaltz وباور </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 مل زجاجة فراغ نظام تصفية / التخزين، 0.22 ميكرومتر مسام غشاء 33،2 سم CN ​​2 </td><td> كورنينج </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> لتصوير الكالسيوم </td></tr><tr><td> فلوو-4 AM 1 ملم في DMSO الحل، خلية الدائم </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> الحل بلورونيك F-127 10٪ في المياه </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 نظام مجهر متحد البؤر </td><td> زايس </td><td> نموذج وقف العمل </td><td></td></tr><tr><td> منع الكاشف </td><td> روش </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> نيون لفي الموقع التهجين (FISH) </td></tr><tr><td> مكافحة Digoxigenin-POD، شظايا فاب </td><td> روش </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة DNP-HRP جسم </td><td> بيركن إلمر- </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS استر </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-فلوريسئين </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> الفورماميد، منزوع الأيونات </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> المستخفية RNA، نوع IX </td><td> سيغما الدريخ </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> الهيبارين ملح الصوديوم، من مخاطية الأمعاء لحم الخنزير </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. الكواشف محددة والمعدات. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حل </td><td> مرجع </td><td> محتويات </td></tr><tr><td> خلية مستنبت </td><td> تشانغ وسبيتزر، 2009 54 </td><td> 116 مم كلوريد الصوديوم 0،67 ملي بوكل 2 مم CaCl 2 1.31 مم MgSO 4 4.6 ملم تريس 1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22. تخزين في C. ° 4 </td></tr><tr><td> الكالسيوم والمغنيسيوم مجاني متوسطة (CMF) </td><td> غو وآخرون، 1994 42؛. قو وسبيتزر، 1995 55 </td><td> 116 مم كلوريد الصوديوم 0،67 ملي بوكل 4.6 ملم تريس 0.4 ملم EDTA 1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22. تخزين في C. ° 4 </td></tr><tr><td> المالئيك حمض العازلة (MAB) </td><td> SIVE وآخرون، 2000 53 </td><td> 100 ملم حمض المالئيك 150 مم كلوريد الصوديوم (7.5 درجة الحموضة). </td></tr><tr><td> مارك لقارعو الأجراس معدلة (MMR)، 10X </td><td> SIVE وآخرون، 2000 53 </td><td> 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ملي بوكل 1 ملم MgSO 4 2 مم CaCl 2 5 ملي HEPES درجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 0.1X MMR يحتوي أيضا على 50 ملغ / مل يتم ضبط جنتاميسين سلفات ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. </td></tr><tr><td> MEMFA الحل، 10X </td><td> SIVE وآخرون، 2000 53 </td><td> 0،1 M اجتماعات الأطراف (PH 7.4) 2 مم EGTA 1 ملم MgSO 4 3.7٪ الفورمالديهايد A حل 10X، دون الفورمالديهايد، يمكن تخزينها في C. ° 4 يضاف الفورمالديهايد جديدة (1/10 من حجم المخزون القياسي 37٪). </td></tr><tr><td> في الموقع التهجين العازلة </td><td> SIVه آخرون، 2000 53 </td><td> 50٪ الفورماميد 5X SSC 1 ملغ / مل RNA المستخفية 100 ملغ / مل الهيبارين 1X Denhart في الحل 0.1٪ توين 20 0.1٪ CHAPS 10 ملي EDTA. </td></tr></tbody></table> حلول. * يستخدم جنتاميسين، والمضادات الحيوية، في حين لدينا حلول MMR يتم استخدام البنسلين والستربتوميسين في وسائل الإعلام ثقافتنا. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

العملية التي من خلالها المنطقة الأمامية من لوحة تثير العصبية في الشبكية الفقارية لا يزال يشكل محورا رئيسيا من البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. بالإضافة إلى أهمية واضحة الطبية لفهم وعلاج مرض الشبكية، وتطوير شبكية العين الفقارية تواصل لتكون بمثابة نظام نموذجا هاما وأنيقة لفهم الخلية العصبية والتمايز تقرير نوع 1-16. العصبية في الشبكية تتكون من ستة أنواع الخلايا المنفصلة (العقدة، مبصرات عديم الاستطالات، الأفقي، وخلايا القطبين، والخلايا الدبقية مولر) مرتبة في طبقات النمطية، وهو النمط الذي يتم حفظها بشكل كبير بين جميع الفقاريات 12،14-18. أثناء الدراسة في الشبكية سليمة في الجنين النامية هو مطلوب بوضوح لفهم كيفية تطور هذا الجهاز المعقد من بروز الدماغ الأمامي في هيكل الطبقات، وهناك العديد من الأسئلة التي تفيد جيئة وذهابام توظيف النهج باستخدام زراعة الخلايا الأولية من خلايا الشبكية المفترض 7،19-23. على سبيل المثال، وتحليل الخلايا من الأنسجة وإزالة فصلها في مراحل مختلفة يسمح احد لتبين حالة تحديد الخلايا الفردية في مراحل نمو مختلفة، وهذا هو، مصير الخلايا في غياب التفاعل مع الأنسجة المجاورة 8،19-22 ،24-33. زراعة الخلايا الأولية كما يسمح المحقق لعلاج الثقافة مع الكواشف محددة وتحليل النتائج على مستوى خلية واحدة 5،8،21،24،27-30،33-39. القيطم المورق، ونظام النموذج التقليدي لدراسة التنمية في وقت مبكر العصبية 19،27،29،31-32،40-42، بمثابة مناسبة خاصة لنظام الشبكية زراعة الخلايا الأولية 10،38،43-45. الأنسجة الشبكية الافتراضي يمكن الوصول إليها من المراحل الأولى من التنمية، مباشرة بعد تحريض العصبية 25،38،43. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا عشرفي كل خلية في الجنين يحتوي على توريد صفار، يمكن زرعها في خلايا شبكية العين وسائل الإعلام تعريف بسيط جدا يتكون من محلول ملحي مخزنة، وبالتالي إزالة آثار الخلط من الحضانة أو غيرها من المنتجات القائمة على الأمصال 10،24،44-45 . ومع ذلك، فإن عزل الأنسجة الشبكية من الأنسجة المحيطة والمعالجة اللاحقة يمثل تحديا. هنا، نقدم طريقة لتشريح وتفكك خلايا الشبكية في المورق القيطم التي سيتم استخدامها لإعداد الثقافات الخلية الأولية التي من شأنها، في المقابل، يتم تحليلها لنشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في الخلايا القرار واحد. في حين أن الموضوع المقدمة في هذه الورقة هو تحليل الكالسيوم العابرين عفوية، والتقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية والنهج (الشكل 1).

وترد أمثلة على الحويصلات البصرية تشريح بنجاح (المرحلة 25) والشبكية (المرحلة 35) في أرقام 2E و2J. في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول في مراحل مختلفة من التنمية، فإن من الأهمية بمكان الحصول على الأنسجة الشبكية فقط لضمان الدقة لتجارب أخرى. إزالة بعناية البشرة في جمي...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

العزلة والثقافة من خلايا الفئران العصبية الجنينية: بروتوكول سريعة

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

يزدرع الثقافات العصبية من<em&gt; القيطم المورق</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

والفحص السلوكية بسيطة لاختبار وظيفة البصرية في<em&gt; القيطم المورق</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...