Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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我们亲切地感谢约翰·海斯博士脚本，博士。埃里克·布拉德利和克里斯托弗·德尔 - 内格罗共聚焦显微镜的帮助;德鲁·休斯，劳拉ODORIZZI，亚历Garafalo，丽贝卡Lowden，和Liz麦克默里对他们的工作在发展该项目，并提供初步的数据统计分析有用的建议;格雷戈·史密斯博士。这项工作是由美国国立卫生研究院授予（NINDS IR15N5067566 01）MSS和霍华德休斯医学研究所的科学教育补助金的威廉和玛丽学院支持。

所有的实验都完成后的实验动物护理和使用委员会在威廉和玛丽学院批准的协议。在本协议中引用的发展阶段根据Nieuwkoop和Faber 46的 。 1。解剖<ol><li>允许的细胞培养液中的钙，镁免费中等（CMF），以平衡至室温。您还需要0.1X马克的改良林格（MMR）的pH值7.4-7.6。 </li><li>消毒通过施加在细胞培养层流罩30分钟的UV光对以下项目。 （喷每个资料前放置在通风橱中，用70％...

凭借其良好的特点是保守的细胞类型，在所有脊椎动物中，视网膜提供了一个有用的模型研究细胞的分子过程规范和分化细胞类型。原代细胞培养提供了一个功能强大的方法，调查范围广泛的过程，包括基因表达，蛋白质动力学，钙和电活动在单细胞分辨率水平。在这里，我们提出了一个简单的原代细胞培养技术，从解剖假定视网膜组织在非洲爪蟾 ，特别适合生物体进行此类研究的假定，...

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂的名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 对于解剖和培养 </td></tr><tr><td> BD猎鹰易握组织培养皿，35毫米</td><td>费舍尔</td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯培养皿中，60 x 15毫米</td><td>费舍尔</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35毫米Nunclon表面的培养皿（与Airvent） </td><td>费舍尔</td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td>蒙特精钳（Dumostar＃55） </td><td>费舍尔</td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice微统治塑料盖玻片，25毫米</td><td>费舍尔</td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td>甲烷磺酸乙基 - 间 - 氨基苯甲酸盐（MS-222） </td><td> MP Biomedicals，LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>恩佐生命科学</td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco公司的胰蛋白酶（1:250）粉末</td><td> Life Technologies公司</td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> 溶组织梭菌胶原酶B从</td><td>罗氏公司</td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td>青霉素 - 链霉素</td><td> Gibco公司</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>耐尔蓝硫酸盐（可选） </td><td> Pfaltz＆鲍尔</td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500毫升真空过滤机/存储瓶系统，0.22μm孔径33.2平方厘米 CN膜</td><td>康宁</td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> 对于钙成像 </td></tr><tr><td>氟凌晨4点1毫米的DMSO溶液，细胞永久</td><td> Life Technologies公司</td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td>的Pluronic F-127 10％水溶液</td><td> Life Technologies公司</td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510共聚焦显微镜系统</td><td>蔡司</td><td>型号停产</td><td></td></tr><tr><td>阻断剂</td><td>罗氏公司</td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 对于荧光原位杂交（FISH） </td></tr><tr><td>抗地高辛过氧化物酶（POD），Fab片段</td><td>罗氏公司</td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td>抗-DNP-HRP抗体</td><td> Perkin-Elmer公司</td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> CY3NHS酯</td><td> GE医疗集团</td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-荧光素</td><td> Thermo Scientific的</td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺，去离子水</td><td> AMRESCO </td><td> 0606-950毫升</td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA，IX型</td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐，从猪小肠粘膜</td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2中。具体的试剂和设备。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 解 </td><td> 参考 </td><td> 内容 </td></tr><tr><td>细胞培养液</td><td>张和斯皮策2009年54 </td><td> 116毫米的NaCl 0.67毫米氯化钾 2毫米氯化钙 1.31毫米硫酸镁 4.6毫米的Tris 1％（体积比）青霉素/链霉素 用盐酸调节pH值至7.8。 通过0.22μm的CN过滤器过滤灭菌。 存放于4℃ </td></tr><tr><td>钙，镁培养基（CMF） </td><td> Gu 等人 ，1994年42谷和斯皮策，1995年55 </td><td> 116毫米的NaCl 0.67毫米氯化钾 4.6毫米的Tris 0.4 mM的EDTA 1％（体积比）青霉素/链霉素 用盐酸调节pH值至7.8。 通过0.22μm的CN过滤器过滤灭菌。 存放于4℃ </td></tr><tr><td>马来酸缓冲液（MAB） </td><td>西伯等人，2000年53 </td><td> 100毫米马来酸 150mM的NaCl（pH 7.5）中。 </td></tr><tr><td>马克的改良林格（MMR），10X </td><td>西伯等人，2000年53 </td><td> 100mM NaCl的 mM KCl中 1毫米硫酸镁 2毫米氯化钙 5毫米HEPES 用NaOH调节pH至7.4 0.1X MMR还含有50毫克/毫升的硫酸庆大霉素和pH用NaOH调至7.4。 </td></tr><tr><td> MEMFA解决方案，10X </td><td>西伯等人，2000年53 </td><td> 0.1 M MOPS（pH值7.4） 2毫米EGTA 1毫米硫酸镁 3.7％的甲醛 甲10X溶液，无甲醛，可以被存储在4℃下甲醛加入新鲜的（1/10体积的一个标准的37％的股份）。 </td></tr><tr><td> 原位杂交缓冲液</td><td> ·西夫E 等人，2000年53 </td><td> 50％甲酰胺 5X SSC 1毫克/毫升Torula核糖核酸 100毫克/毫升肝素 1X Denhart的解决方案 0.1％吐温20的 0.1％CHAPS的 10mM的EDTA。 </td></tr></tbody></table> 的解决方案。*庆大霉素，抗生素，用于在我们的MMR解决方案，而在我们的培养基使用青 ​​霉素和链霉素。 </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

前区的神经板产生的脊椎动物视网膜的过程仍然是一个重大的临床和基础研究的重点。除了 ​​明显的理解和治疗视网膜疾病的医疗相关的脊椎动物视网膜的发展作为一项重要而优雅的模型系统的理解决定和分化的神经元细胞类型1-16。的视网膜神经由6个独立单元（神经节细胞，无长突细胞，水平，感光细胞，双极细胞和Müller胶质细胞），其布置在定型层，一个模式，主要是保守的所有脊椎动物12,14-18。 在学习的完整胚胎发育的视网膜中明确要求的理解这个复杂的器官如何发展一个突出的前脑的层状结构，有很多问题，有利于从米采用采用推定视网膜细胞的原代细胞培养7,19-23。例如，分析细胞组织去除和分离在不同的阶段可以辨别的状态规格的单个细胞在不同的发展阶段，也就是细胞的命运的情况下与周围组织的相互作用8,19-22 ,24-33。原代细胞培养也允许调查员来处理与特定的试剂和文化上单个细胞水平5,8,21,24,27-30,33-39的，分析的结果。一个经典的模型系统，研究非洲爪蟾，早期神经发展19,27,29,31-32,40-42的 ，作为一个特别合适的视网膜原代细胞培养系统10,38,43-45。 推定视网膜组织从最初的发展阶段，紧随神经诱导25,38,43。此外，由于日胚胎在每个单元格中包含的供给蛋黄，视网膜细胞的培养可以在一个非常简单的定义的介质组成的一个缓冲的盐溶液中，从而消除了混杂影响的潜伏期或其他血清型产品10,24,44-45 。 然而，从周围组织和随后的处理的视网膜组织的隔离是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种方法，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）的视网膜细胞，将被用于制备原代细胞培养，反过来，在单一细胞的分辨率的的钙活性和基因表达进行分析的解剖和解离。虽然本文介绍的主题是自发性钙瞬变分析，该技术广泛适用于广泛的研究问题和方法（ 图1）。

成功解剖视神经的囊泡（阶段25）和视网膜（阶段35）的实施例示于图2E和2J。虽然这种协议可以用于在不同的开发阶段，这是至关重要的，从而只获得视网膜组织确保准确性的进一步的实验。小心地去除表皮的各个阶段，并确保您的镊子不要刺穿视网膜组织。 35岁或以上在第二阶段中，透镜可以看到作为一个透明层的顶部的视网膜和可以由谨慎刮削使用镊子除去。 <p class="jove_content...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

非洲爪蟾提供了一个理想的模型系统，为研究细胞命运和生理功能的个人视网膜细胞的原代细胞培养。在这里，我们提出了一种技术，用于解剖视网膜组织并产生成像的原代细胞培养活性钙和原位杂交分析。

解剖，文化与分析<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;胚胎视网膜组织

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

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A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

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The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

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