Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

We genadiglijk danken Dr John Hayes voor scripts; Drs. Eric Bradley en Christopher Del Negro voor hulp bij confocale microscopie; Drew Hughes, Laura ODORIZZI, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, en Liz MacMurray voor hun werk in de ontwikkeling van het project en het verstrekken van voorlopige gegevens, dr. Greg Smith voor nuttige suggesties op de statistische analyse. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie ​​(NINDS IR15N5067566-01) voor MSS en een Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant aan het College of William and Mary.

Alle experimenten worden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het College of William and Mary. Ontwikkelingsstadia waarnaar in dit protocol zijn volgens Nieuwkoop en Faber 46. 1. Ontleding <ol><li> Laat het celkweekmedium en Calcium Magnesium vrij medium (CMF) equilibreren tot kamertemperatuur. U zult ook moeten 0,1 x Marc&#39;s Gemodificeerd Ringer (MMR) pH 7,4-7,6. </li><li> Steriliseer de volgende door een UV licht ...

Met zijn goed gekarakteriseerd celtypen die geconserveerd zijn in alle vertebraten, de retina een nuttig model voor het bestuderen van de moleculaire cellulaire processen die celtype specificatie en differentiatie. Primaire celkweek biedt een krachtige methode voor het onderzoeken van een groot aantal processen waaronder genexpressie, eiwit dynamiek en calcium en elektrische activiteit op het niveau van enkele cel resolutie. Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor het primaire celkweek van ontleed vermoedelijke...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Voor Dissections en kweken </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip weefselkweekplaten, 35 mm </td><td> Visser </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Eenmalige polystyreen Petrischalen, 60 x 15 mm </td><td> Visser </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Oppervlakte Petrischalen (met Airvent) </td><td> Visser </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Fijne tang (Dumostar # 55) </td><td> Visser </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-geregeerd kunststof dekglaasje, 25 mm </td><td> Visser </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicinesulfaat </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco trypsine (1:250) Powder </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase uit Clostridium histolyticum B </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue Sulfaat (optioneel) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml Vacuum Filter / Storage Bottle System, 0,22 pm Pore 33,2 cm 2 GN-Membraan </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Voor Calcium Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM oplossing in DMSO, Cell Permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% oplossing in water </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 confocale microscoop System </td><td> Zeiss </td><td> Model Discontinued </td><td></td></tr><tr><td> Blocking Reagent </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenine-POD, Fab fragmenten </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP antilichaam </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-fluoresceïne </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide, gedeïoniseerd </td><td> Amresco </td><td> 0606-capaciteit van 950 </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, Type IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Heparine Natrium Zout, van Varkens darmslijmvlies </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Oplossing </td><td> Verwijzing </td><td> Inhoud </td></tr><tr><td> Celkweekmedium </td><td> Chang en Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl2 1,31 mM MgSO4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicilline / Streptomycine Breng de pH tot 7,8 met HCl. Filter steriliseer door passage door een 0,22 urn filter CN. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcium-Magnesium Gratis Medium (CMF) </td><td> Gu et al., 1994 42;. Gu en Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicilline / Streptomycine Breng de pH tot 7,8 met HCl. Filter steriliseer door passage door een 0,22 urn filter CN. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Maleïnezuur Buffer (MAB) </td><td> Sive et al.., 2000 53 </td><td> 100 mM maleïnezuur 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marc&#39;s Modified Ringers (MMR), 10X </td><td> Sive et al.., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH ingesteld op 7,4 met NaOH 0,1 x MMR bevat ook 50 mg / ml gentamicinesulfaat en pH op 7,4 met NaOH. </td></tr><tr><td> MEMFA Solution, 10X </td><td> Sive et al.., 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3,7% formaldehyde Een 10X oplossing zonder formaldehyde kan worden opgeslagen bij 4 ° C. Formaldehyde toegevoegd vers (1/10 volume van een standaard stock 37%). </td></tr><tr><td> In situ hybridisatie Buffer </td><td> Sive et al.., 2000 53 </td><td> 50% Formamide 5X SSC 1 mg / ml RNA Torula 100 mg / ml heparine 1X Denhart&#39;s Solution 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Oplossingen. * Gentamicine, een antibioticum, wordt in onze MMR oplossingen, terwijl penicilline en streptomycine worden gebruikt in onze kweekmedia. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Het proces waarbij het front van de neurale plaat leidt tot het vertebrate retina blijft een belangrijke focus van zowel klinisch en fundamenteel onderzoek. Naast de duidelijke medische belang voor het begrijpen en behandelen van retinale ziekte, de ontwikkeling van de vertebrate retina nog steeds als een belangrijk en elegant model voor begrip neuronale celtypen bepaling en differentiatie 1-16. De neurale retina bestaat uit zes discrete celtypes (ganglion, amacrine, horizontaal, fotoreceptoren, bipolaire cellen en gliacellen Müller) aangebracht in stereotype lagen, een patroon dat grotendeels geconserveerd onder alle gewervelde dieren 12,14-18. Bij het bestuderen van het netvlies in het intacte ontwikkelende embryo is duidelijk nodig om te begrijpen hoe dit complexe orgaan ontwikkelt van een uitsteeksel van de voorhersenen in een gelaagde structuur, zijn er veel vragen die weer ten goede komenm dienst benaderingen met behulp van primaire celculturen van vermoedelijke retinale cellen 7,19-23. Bijvoorbeeld analyseren cellen van weefsels verwijderd en gedissocieerd in verschillende stadia kan men de stand van specificatie van individuele cellen onderscheiden in verschillende ontwikkelingsstadia, namelijk het lot van de cellen in afwezigheid van interactie met naburige weefsels 8,19-22 ,24-33. Primaire celkweek maakt ook de onderzoeker de cultuur behandelen met specifieke reagentia en de resultaten te analyseren op een enkele cel 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, een klassiek model voor de studie van vroege neurale ontwikkeling 19,27,29,31-32,40-42 dient als bijzonder geschikt voor retinale primaire celkweek 10,38,43-45. Vermoedelijke retinale weefsel is bereikbaar vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling, onmiddellijk na neurale inductie 25,38,43. Daar bovendien thbij elke cel in het embryo een voorraad dooier bevat, retinale cellen kunnen worden gekweekt in een zeer eenvoudige gedefinieerde media bestaande uit een gebufferde zoutoplossing, waardoor de tot verstorende effecten van incubatie of andere sera gebaseerde producten 10,24,44-45 . Echter de isolatie van het retinale weefsel van de omringende weefsels en de daaropvolgende bewerking uitdaging. Hier geven we een werkwijze voor de ontleding en dissociatie van retinale cellen in Xenopus laevis die gebruikt worden om primaire celculturen die op hun beurt worden geanalyseerd op calcium activiteit en genexpressie op de resolutie van afzonderlijke cellen te bereiden. Terwijl het onderwerp in deze paper is de analyse van spontane calcium transiënten, de techniek is breed toepasbaar voor een breed scala aan onderzoeksvragen en-benaderingen (figuur 1).

Voorbeelden van succes ontleed optische vesicles (fase 25) en retinae (trap 35) worden getoond in de figuren 2E en 2J. Hoewel dit protocol kunnen worden gebruikt in verschillende stadia van ontwikkeling, is het essentieel om alleen netvliesweefsel verkrijgen nauwkeurigheid voor verdere experimenten waarborgen. Verwijder voorzichtig de opperhuid in alle stadia en ervoor te zorgen dat uw tang niet doorboren de retinale weefsel. In fase 35 jaar of ouder, kan de lens worden beschouwd als een heldere laag bo...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...