Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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Nous remercions gracieusement le Dr John Hayes pour son exécution; Drs. Eric Bradley et Christopher Del Negro à l&#39;aide de la microscopie confocale, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garofalo, Rebecca Lowden, et Liz MacMurray pour leur travail dans le développement du projet et de fournir des données préliminaires, le Dr Greg Smith pour leurs suggestions utiles pour l&#39;analyse statistique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (NINDS IR15N5067566-01) à la norme MSS et du Howard Hughes Medical Institute Science Education Subvention au Collège de William et Mary.

Toutes les expériences sont réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation au College of William and Mary. Stades de développement mentionnés dans le présent protocole sont conformes à Nieuwkoop et Faber 46. 1. Dissection <ol><li> Laisser le milieu de culture cellulaire et de magnésium de calcium libre moyen (CMF) s&#39;équilibrer à la température ambiante. Vous devrez également 0,1 X de Marc jour Ringer (RO...

Avec ses types cellulaires bien caractérisées qui sont conservées dans tous les vertébrés, la rétine fournit un modèle utile pour l&#39;étude des processus cellulaires qui régissent moléculaire spécification du type cellulaire et la différenciation. Culture de cellules primaires donne une puissante méthode pour étudier un grand nombre de processus, y compris l&#39;expression des gènes, la dynamique des protéines et du calcium et de l&#39;activité électrique au niveau de la résolution cellule unique. N...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Pour dissections et la culture </td></tr><tr><td> BD Falcon Facile Plats Grip Culture de tissus, 35 mm </td><td> Pêcheur </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Boîtes de Pétri jetables en polystyrène, 60 x 15 mm </td><td> Pêcheur </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Surface Nunclon boîtes de Pétri (avec Airvent) </td><td> Pêcheur </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont fin forceps (Dumostar # 55) </td><td> Pêcheur </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-jugé en plastique lamelle 25 mm </td><td> Pêcheur </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Éthyl-m-aminobenzoate Methanesulfonate Sel (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de gentamicine </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380 à 003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco trypsine (1:250) Poudre </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase B de Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nil Bleu Sulfate (facultatif) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> Vide de 500 ml Bouteille Filter System / Storage, 0,22 um des pores membranaires CN 33,2 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Pour l&#39;imagerie calcique </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 Solution mM dans du DMSO, Cell permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Solution Pluronic F-127 10% dans l&#39;eau </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Système Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> Modèle Discontinued </td><td></td></tr><tr><td> Blocage réactif </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Pour hybridation fluorescente in situ (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine-POD, Fab Fragments </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP anticorps </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3Ester de NHS </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-fluorescéine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide, déminéralisée </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula ARN, de type IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Sel de sodium de l&#39;héparine, de muqueuse intestinale de porc </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Solution </td><td> Référence </td><td> Contenu </td></tr><tr><td> Milieu de culture cellulaire </td><td> Chang et Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM de NaCl 0,67 mM KCl 2 mM de CaCl2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM de Tris 1% (v: v) Pénicilline / Streptomycine Ajuster le pH à 7,8 avec HCl. Stériliser par filtration en passant à travers un filtre de 0,22 um CN. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcium-Magnesium moyen gratuit (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42;. Gu et Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM de NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM de Tris 0,4 mM d&#39;EDTA 1% (v: v) Pénicilline / Streptomycine Ajuster le pH à 7,8 avec HCl. Stériliser par filtration en passant à travers un filtre de 0,22 um CN. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampon acide maléique (MAB) </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 mM d&#39;acide maléique NaCl 150 mM (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marc Ringer à jour (ROR), 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> NaCl 100 mM mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM de CaCl2 HEPES 5 mM pH ajusté à 7,4 avec NaOH 0,1 X MMR contient également 50 mg / ml de sulfate de gentamicine et le pH est ajusté à 7,4 avec NaOH. </td></tr><tr><td> Solution MEMFA, 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) EGTA 2 mM 1 mM MgSO 4 Formaldéhyde 3,7% Une solution 10X, sans formaldéhyde, peuvent être conservés à 4 ° C. Le formaldéhyde est ajouté fraîche (1/10 de volume d&#39;un stock standard 37%). </td></tr><tr><td> Dans tampon d&#39;hybridation in situ </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> Le formamide 50% 5X SSC 1 mg / ml d&#39;ARN Torula 100 mg / ml d&#39;héparine 1X Denhart de Solution 0,1% de Tween 20 CHAPS 0,1% 10 mM d&#39;EDTA. </td></tr></tbody></table> Solutions. * Gentamicine, un antibiotique, est utilisée dans nos solutions ROR alors la pénicilline et de la streptomycine sont utilisés dans nos milieux de culture. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Le processus par lequel la région antérieure de la plaque neurale donne lieu à la rétine des vertébrés continue d&#39;être une préoccupation majeure de la recherche clinique et fondamentale. En plus de la pertinence médical évident pour la compréhension et le traitement des maladies de la rétine, le développement de la rétine des vertébrés continue à servir de système modèle important pour la compréhension et élégant type cellulaire et la différenciation neuronale détermination 1-16. La rétine neurale comprend six types de cellules discrètes (ganglion, photorécepteurs amacrines, horizontal, les cellules bipolaires, et les cellules gliales de Müller) disposés en couches stéréotypés, un motif qui est largement conservée parmi tous les vertébrés 12,14-18. Tout en étudiant la rétine de l&#39;embryon intact le développement est clairement nécessaire pour comprendre comment cet organe complexe se développe à partir d&#39;une saillie du cerveau antérieur dans une structure en couches, il ya beaucoup de questions qui profitent vientm employant des approches utilisant la culture cellulaire primaire de présumées cellules rétiniennes 7,19-23. Par exemple, en analysant les cellules de tissus prélevés et dissociés à des stades différents permet de discerner l&#39;état de la spécification de cellules individuelles à différents stades de développement, qui est, le sort des cellules en l&#39;absence d&#39;interaction avec les tissus voisins 8,19-22 ,24-33. Culture de cellules primaires permet également au chercheur de traiter la culture avec des réactifs spécifiques et analyser les résultats au niveau unicellulaire 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un système modèle classique pour l&#39;étude des le développement neural précoce 19,27,29,31-32,40-42, sert de système particulièrement adapté à la culture des cellules rétiniennes primaires 10,38,43-45. Présomption de tissu rétinien est accessible dès les premiers stades de développement, immédiatement après l&#39;induction neurale 25,38,43. En outre, étant donné eà chaque cellule de l&#39;embryon contient une réserve de jaune d&#39;œuf, les cellules rétiniennes peuvent être cultivées dans un milieu très simples définis constituées d&#39;une solution saline tamponnée, éliminant ainsi les effets de confusion d&#39;incubation ou d&#39;autres sérums à base de produits 10,24,44-45 . Cependant, l&#39;isolement du tissu rétinien à partir des tissus environnants et le traitement subséquent est un défi. Ici, nous présentons une méthode pour la dissection et la dissociation des cellules de la rétine dans Xenopus laevis qui seront utilisés pour préparer des cultures de cellules primaires qui, à leur tour, être analysés pour l&#39;activité de calcium et de l&#39;expression des gènes à la résolution de cellules individuelles. Bien que le sujet présenté dans cet article est l&#39;analyse des transitoires calciques spontanées, la technique est largement applicable à un large éventail de questions de recherche et des approches (Figure 1).

Des exemples de succès disséqués vésicules optiques (étape 25) et la rétine (stade 35) sont présentés dans les figures 2E et 2J. Bien que ce protocole peut être utilisé à différents stades de développement, il est essentiel d&#39;obtenir que le tissu rétinien pour assurer l&#39;exactitude pour d&#39;autres expériences. Retirez délicatement l&#39;épiderme à tous les stades et s&#39;assurer que vos pinces à ne pas percer le tissu rétinien. Dans l&#39;étape 35 ans ou plus, la lentille ...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l&#39;activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

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