Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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Wir huldvoll danken Dr. John Hayes für Skripte; Drs. Eric Bradley und Christopher Del Negro für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, und Liz MacMurray für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Projekts und die Bereitstellung vorläufige Daten; Dr. Greg Smith für Anregungen auf einer statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde durch ein NIH (NINDS IR15N5067566-01), um MSS und Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant zum College of William and Mary unterstützt.

Alle Versuche werden folgende Protokolle durch die Institutional Animal Care und Use Committee am College of William and Mary genehmigte durchgeführt. Entwicklungsstadien in diesem Protokoll verwiesen werden nach Nieuwkoop and Faber 46. Ein. Präparation <ol><li> Lassen Sie das Zellkulturmedium und Calcium Magnesium Kostenlose Medium (CMF) auf Raumtemperatur äquilibrieren. Sie müssen auch 0,1 er Marcs modifizierte Ringer-(MMR) pH 7,4-7,6. </li><li> Sterilisieren die folgenden...

Mit seinen gut charakterisierten Zelltypen, die in allen Wirbeltieren konserviert sind, bietet die Netzhaut ein nützliches Modell für die Untersuchung der molekularen zellulären Prozesse, die die Zelltyp Spezifizierung und Differenzierung. Primäre Zellkultur bietet eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung einer Vielzahl von Prozessen einschließlich Genexpression, Protein Dynamik und Kalzium und elektrische Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zelle Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Für Dissektionen und Kultivierung </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip Zellkulturschalen, 35 mm </td><td> Fischer </td><td> 08-772a </td><td></td></tr><tr><td> Einweg Polystyrol Petrischalen, 60 x 15 mm </td><td> Fischer </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Oberfläche Petrischalen (mit Airvent) </td><td> Fischer </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont feinen Pinzette (Dumostar # 55) </td><td> Fischer </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-regierten Kunststoff Deckglas, 25 mm </td><td> Fischer </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl-m-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicinsulfat </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco Trypsin (1:250) Powder </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase B aus Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue Sulfate (optional) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml Vacuum Filter / Storage Bottle System, 0,22 um Pore 33,2 cm 2 CN Membrane </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Für Calcium Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM Lösung in DMSO, Cell Permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14.217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% Lösung in Wasser </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Konfokale Mikroskop-System </td><td> Zeiss </td><td> Modell Discontinued </td><td></td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-POD, Fab-Fragmenten </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-Antikörper-HRP </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS-Ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid, Deionisiertes </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, Typ IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin Sodium Salt, Darmschleimhaut von Schweinen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Referenz </td><td> Inhalt </td></tr><tr><td> Cell Culture Medium </td><td> Chang und Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl. Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcium-Magnesium Kostenlose Medium (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42;. Gu und Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl. Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Maleinsäure-Puffer (MAB) </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 mM Maleinsäure 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marcs Modified Ringers (MMR), 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM CaCl 2 5 mM HEPES pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt 0,1 X MMR enthält auch 50 mg / ml Gentamicinsulfat und der pH wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt. </td></tr><tr><td> MEMFA Solution, 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO 4 3,7% Formaldehyd A 10X Lösung, ohne Formaldehyd, bei 4 ° C gelagert werden Formaldehyd zugegeben frischen (1/10 Volumen einer Standard-37% Aktien). </td></tr><tr><td> In-situ-Hybridisierung Buffer </td><td> SivE et al., 2000 53 </td><td> 50% Formamid 5X SSC 1 mg / ml RNA Torula 100 mg / ml Heparin 1X Denharts Lösung 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Solutions. * Gentamicin, ein Antibiotikum, wird in unserem MMR-Lösungen verwendet werden, während Penicillin und Streptomycin in unserer Kultur Medien verwendet werden. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Der Prozess, durch den vorderen Bereich des Neuralplatte ergibt sich die Retina von Wirbeltieren weiterhin ein wichtiger Schwerpunkt der klinischen und der Grundlagenforschung sein. Neben der offensichtlichen medizinischen Relevanz für das Verständnis und die Behandlung von Netzhauterkrankungen, weiterhin die Entwicklung der Retina von Wirbeltieren als ein wichtiges und elegantes Modell für das Verständnis neuronaler Zelltyp Bestimmung und Unterscheidung 1-16 dienen. Das neurale Retina besteht aus sechs diskrete Zelltypen (Ganglion amakrinen, horizontal, Fotorezeptoren, bipolaren Zellen, und Müller Gliazellen) in stereotypen Schichten angeordnet sind, ein Muster, das weitgehend unter allen Vertebraten 12,14-18 konserviert ist. Während des Studiums der Netzhaut im intakten entwickelnden Embryo ist eindeutig für das Verständnis erforderlich, wie dieses komplexe Organ von einem Vorsprung des Vorderhirns in eine geschichtete Struktur entwickelt, gibt es viele Fragen, die fro profitierenm Einsatz Ansätze unter Verwendung von primären Zellkulturen von mutmaßlichem Netzhautzellen 7,19-23. Beispielsweise Analysieren von Zellen aus Geweben entfernt und dissoziiert in verschiedenen Phasen ermöglicht es, den Stand der Spezifikation der einzelnen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden, das heißt, das Schicksal der Zellen in Abwesenheit von Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben 8,19-22 ,24-33. Primäre Zellkultur ermöglicht auch die Ermittler, die Kultur mit spezifischen Reagenzien zu behandeln und analysieren die Ergebnisse auf einer einzigen Zellebene 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ein klassisches Modellsystem für die Untersuchung von frühen neuralen Entwicklung 19,27,29,31-32,40-42, dient als ein besonders geeignetes System zur Netzhaut primäre Zellkultur 10,38,43-45. Mutmaßlich Netzhautgewebe ist von den frühesten Stadien der Entwicklung, unmittelbar nach neuralen Induktion 25,38,43. Darüber hinaus, th gegebenbei dem jede Zelle im Embryo eines Vorrats von Eigelb enthält, retinaler Zellen in einem sehr einfachen definierten Medien, bestehend aus einer gepufferten Salzlösung kultiviert werden, wodurch das Entfernen der Wirkung von Störfaktoren Inkubation Seren oder anderen Produkten auf 10,24,44-45 . Allerdings ist die Isolierung des Retinagewebe vom umgebenden Gewebe und der nachfolgenden Verarbeitung schwierig. Hier stellen wir ein Verfahren zur Präparation und Dissoziation von Retinazellen in Xenopus laevis, die zum primären Zellkulturen, die wiederum für Calcium Aktivität und Genexpression bei der Auflösung von einzelnen Zellen analysiert werden vorbereitet wird. Während das Thema in diesem Papier ist die Analyse der spontanen Kalzium Transienten ist die Technik breit anwendbar auf ein breites Spektrum von Fragestellungen und Ansätze (Abbildung 1).

Beispiele von erfolgreich seziert Augenblasen (Stadium 25) und retinae (Stufe 35) sind in den Figuren 2E und 2J gezeigt. Während dieses Protokoll in verschiedenen Stadien der Entwicklung verwendet werden kann, ist es entscheidend, um nur Retinagewebe zu erhalten, um die Genauigkeit für weitere Experimente gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis in allen Phasen und sicherzustellen, dass Ihre Pinzette nicht Punktion der Netzhautgewebe. In der Stufe 35 oder älter, kann die Linse als klare...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

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Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

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Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...