Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

אנו מודים אדיבות ד&quot;ר ג&#39;ון הייס לתסריטים; בני זוג. אריק בראדלי וכריסטופר דל ניגר לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal; דר יוז, לורה Odorizzi, אלכס Garafalo, רבקה Lowden, וליז MacMurray עבור עבודתם בפיתוח פרויקט ומתן נתונים ראשוניים; ד&quot;ר גרג סמית להצעות מועילות על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (NINDS IR15N5067566-01) לMSS והווארד יוז הרפואי במכון לחינוך מדעי גרנט למכללת ויליאם ומרי.

כל הניסויים שבוצעו בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש במכללת ויליאם ומרי. שלבי התפתחות הפניה בפרוטוקול זה הם על פי Nieuwkoop ופייבר 46. 1. בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">...

עם סוגי תאים המאופיינים היטב הנשמרים לאורך כל החוליות, הרשתית מספקת מודל שימושי לחקר התהליכים מולקולריים התאיים המסדירים מפרט ובידול סוג תא. תרבית תאים ראשונית מקנה שיטה רבה עצמה לחקר מגוון רחב של תהליכים, כולל ביטוי גנים, דינמיקת חלבון וסידן ופעילות חשמלית ברמת רזו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לניתוחים וculturing </td></tr><tr><td> מנות BD פלקון קלות גריפ רקמות תרבות, 35 מ&quot;מ </td><td> דיג </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> כלים חד פוליסטירן פטרי, 60 15 מ&quot;מ x </td><td> דיג </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 מנות מ&quot;מ Nunclon Surface פטרי (עם Airvent) </td><td> דיג </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> דומון פיין מלקחיים (Dumostar # 55) </td><td> דיג </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice מייקר קבע coverslip פלסטיק, 25 מ&quot;מ </td><td> דיג </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> אתיל-מ-Aminobenzoate Methanesulfonate המלח (MS-222) </td><td> חבר הפרלמנט Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט גנטמיצין </td><td> אנזו מדעי חיים </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco טריפסין (1:250) אבקה </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase B מClostridium histolyticum </td><td> רוש </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט בלו נייל (אופציונלי) </td><td> Pfaltz &amp; באואר </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת סינון אבק 500 מ&quot;ל / אחסון בקבוקים, 0.22 מיקרומטר ממברנה הנקבובית 33.2 סנטימטר 2 CN </td><td> קורנינג </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> לדימות סידן </td></tr><tr><td> Fluo-04:00 פתרון 1 מ&quot;מ DMSO, תא קבוע </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> ה-F-127 10% פתרון Pluronic במים </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת מיקרוסקופ LSM 510 Confocal </td><td> Zeiss </td><td> דגם הופסק </td><td></td></tr><tr><td> חסימת מגיב </td><td> רוש </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לפלורסנט כלאה באתר (FISH) </td></tr><tr><td> אנטי Digoxigenin-POD, שברי Fab </td><td> רוש </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי DNP-HRP </td><td> פרקין אלמר- </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS אסטר </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide, deionized </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula רנ&quot;א, הסוג IX </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> מלח נתרן הפארין, מרירית מעי חזירית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> בחורים </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 2. ריאגנטים וציוד ספציפיים. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון </td><td> עיון </td><td> תוכן </td></tr><tr><td> בינוני תא תרבות </td><td> צ&#39;אנג ושפיצר, 2009 54 </td><td> 116 המ&quot;מ NaCl 0.67 mM KCl 2 המ&quot;מ CaCl 2 1.31 mM MgSO 4 4.6 mM טריס % 1 (v: v) פניצילין / סטרפטומיצין התאם pH ל 7.8 עם HCl. סנן לעקר על ידי עובר דרך מסנן CN מיקרומטר 0.22. לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> סידן מגנזיום בינוני חינם (CMF) </td><td> הגו et al, 1994 42;. גו ושפיצר, 1995 55 </td><td> 116 המ&quot;מ NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM טריס 0.4 המ&quot;מ EDTA % 1 (v: v) פניצילין / סטרפטומיצין התאם pH ל 7.8 עם HCl. סנן לעקר על ידי עובר דרך מסנן CN מיקרומטר 0.22. לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> מאגר החומצה Maleic (MAB) </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 חומצת maleic mM 150 המ&quot;מ NaCl (pH 7.5). </td></tr><tr><td> אצבעותיו של מארק השינוי (MMR), 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 המ&quot;מימ NaCl mM KCl 1 המ&quot;מ MgSO 4 2 המ&quot;מ CaCl 2 5 מ&quot;מ HEPES חומציות מותאמת ל7.4 עם NaOH 0.1x MMR מכיל גם 50 מ&quot;ג / המ&quot;ל גנטמיצין סולפט והחומציות מותאם ל 7.4 עם NaOH. </td></tr><tr><td> פתרון MEMFA, 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 0.1 מגבי M (pH 7.4) 2 המ&quot;מ EGTA 1 המ&quot;מ MgSO 4 3.7% פורמלדהיד פתרון 10X, ללא פורמלדהיד, ניתן לאחסן ב 4 ° C. פורמלדהיד הוסיף טרי (1/10 נפח של 37% מניות רגילות). </td></tr><tr><td> במאגר ההכלאה באתר </td><td> סיבדואר et al., 2000 53 </td><td> 50% פוראמיד SSC 5X 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל Torula רנ&quot;א 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל הפרין הפתרון של 1X Denhart 0.1% Tween 20 בחורי 0.1% 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> פתרונות. * גנטמיצין, אנטיביוטיקה, משמש בפתרונים שלנו, תוך MMR פניצילין וסטרפטומיצין משמשים בתקשורת התרבות שלנו. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

התהליך שבו האזור הקדמי של הצלחת העצבית מעורר רשתית החוליות ממשיך להיות מוקד עיקרי של מחקר קליני ובסיסי. בנוסף לרלוונטיות הרפואיות הברורות להבנה וטיפול במחל רשתית, הפיתוח של רשתית החוליות ממשיך לשמש כמערכת מודל חשובה ואלגנטית לנחישות הבנה עצבית תא סוג ובידול 1-16. הרשתית העצבית מורכבת משישה סוגים בדידים תא (גנגליון, photoreceptors amacrine, אופקי, תאים דו קוטביים, ותאי גליה מולר) מסודרים בשכבות סטריאוטיפיות, דפוס הנשמר במידה רבה בין כל החוליות 12,14-18. בעוד לומד רשתית בעובר מתפתח בשלמות נדרשה באופן ברור להבנה כיצד האיבר המורכב הזה מתפתח מבליטה של ​​המוח הקדמי למבנה שכבתי, ישנן שאלות רבות שתועלנה לכאן ולכאןמ העסקת גישות באמצעות תרבית תאים ראשוניות של תאי רשתית משוערים 7,19-23. לדוגמה, ניתוח תאים מרקמות שהוסרו וניתקו בשלבים שונים מאפשר לאדם להבחין במצב של מפרט של תאים בודדים בשלבי התפתחות שונים, כלומר, גורלם של התאים בהיעדר אינטראקציות עם רקמות שכנות 8,19-22 ,24-33. תרבית תאים עיקרית גם מאפשרת לחוקר לטיפול בתרבות עם חומרים כימיים מסוימים ולנתח את התוצאות ברמת תא בודדה 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, מערכת מודל קלסית ללימוד התפתחות עצבית מוקדמת 19,27,29,31-32,40-42, משמשת כמערכת מתאימה במיוחד לתרבות הראשונית של תאי רשתית 10,38,43-45. רקמת רשתית משוערת היא נגישה מהשלבים המוקדמים של פיתוח, מייד לאחר השראה עצבית 25,38,43. בנוסף, ניתן הבכל תא בעובר מכיל אספקה ​​של חלמון, תאי רשתית יכולים להיות מתורבתים בטכניקה פשוטה מאוד שהוגדרה בהיקף של תמיסת מלח שנאגר, וכך להסיר את ההשפעות המבלבלות של דגירה או מוצרים אחרים המבוססים על סרום 10,24,44-45 . עם זאת, הבידוד של רקמת הרשתית מרקמות סובבות ועיבוד שלאחר מכן מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה לנתיחה והניתוק של תאי רשתית בXenopus laevis שישמשו להכנת תרביות תאים ראשוניות שיהיו, בתורו, להיות מנותחים לפעילות הסידן וביטוי גנים ברזולוציה של תאים בודדים. בעוד הנושא שהוצג במאמר זה הוא הניתוח של הארעיים סיד ספונטניים, הטכניקה היא רחב ישימה למגוון רחב של שאלות מחקר וגישות (איור 1).

דוגמאות לשלפוחית ​​נתחה בהצלחה אופטית (שלב 25) ורשתיות עיניים (שלב 35) מוצגות באיורי 2E וי 2. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשלבים שונים של פיתוח, זה הוא קריטי להשגת רקמת רשתית רק כדי להבטיח דיוק לניסויים נוספים. מוציא בזהירות את האפידרמיס בכל השלבים ולהבטיח כי...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...