Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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हम कृपा से लिपियों के लिए धन्यवाद डॉ. जॉन Hayes, डीआरएस. एरिक ब्राडली और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए क्रिस्टोफर डेल हबशी, आकर्षित किया ह्यूजेस, लौरा ODORIZZI, एलेक्स Garafalo, रेबेका Lowden, और लिज़ MacMurray परियोजना को विकसित करने और प्रारंभिक डेटा उपलब्ध कराने में अपने काम के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण पर उपयोगी सुझाव के लिए डा. ग्रेग स्मिथ. यह काम एक NIH एमएसएस के लिए (NINDS IR15N5067566 01) अनुदान और एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट विज्ञान शिक्षा विलियम और मरियम के कॉलेज के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और विलियम और मरियम के कॉलेज में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है. विकास इस प्रोटोकॉल में संदर्भित चरणों Nieuwkoop और फैबर 46 के अनुसार कर रहे ...

इसकी अच्छी तरह से विशेषता कोशिका प्रकार है कि सभी रीढ़ भर में संरक्षित कर रहे हैं, रेटिना आणविक सेलुलर सेल प्रकार विनिर्देश और भेदभाव से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्?...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissections और संवर्धन के लिए </td></tr><tr><td> BD फाल्कन आसान पकड़ टिशू कल्चर बर्तन, 35 मिमी </td><td> मछुआ </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> डिस्पोजेबल Polystyrene पेट्री डिश, 60 x 15 मिमी </td><td> मछुआ </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 मिमी Nunclon भूतल पेट्री डिश (airvent साथ) </td><td> मछुआ </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont ठीक संदंश (# Dumostar 55) </td><td> मछुआ </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> माइक्रो - शासित प्लास्टिक coverslip Cellattice, 25 मिमी </td><td> मछुआ </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> इथाइल मीटर Aminobenzoate Methanesulfonate साल्ट (एमएस 222) </td><td> सांसद BIOMEDICALS, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin सल्फेट </td><td> Enzo लाइफ साइंसेज </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco (1:250) ट्रिप्सिन पाउडर </td><td> जीवन टेक्नोलॉजीज </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से Collagenase बी </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> नील नदी ब्लू सल्फेट (वैकल्पिक) </td><td> Pfaltz और Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 मिलीलीटर बोतल वैक्यूम / फ़िल्टर संग्रहण प्रणाली, 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना 33.2 सेमी 2 CN झिल्ली </td><td> कोर्निंग </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ P&gt; <td></td><td> कैल्शियम इमेजिंग के लिए </td></tr><tr><td> Fluo 4 DMSO में 1 मिमी समाधान, स्थायी सेल </td><td> जीवन टेक्नोलॉजीज </td><td> एफ 14,217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic जल में F-127% 10 समाधान </td><td> जीवन टेक्नोलॉजीज </td><td> पी 6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Confocal माइक्रोस्कोप प्रणाली </td><td> Zeiss </td><td> बंद मॉडल </td><td></td></tr><tr><td> अभिकर्मक अवरुद्ध </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्त (मछली) </td></tr><tr><td> विरोधी Digoxigenin फली, फैब टुकड़े </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> विरोधी DNP एचआरपी एंटीबॉडी </td><td> Perkin - Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3एनएचएस एस्टर </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> एनएचएस - Fluorescein </td><td> थर्मो वैज्ञानिक </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide विआयनीकृत, </td><td> Amresco </td><td> 0,606 - 950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula आरएनए, प्रकार IX </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Porcine आंत्र mucosa से हेपरिन सोडियम साल्ट, </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> H3393 - 250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> तालिका 2 विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरण. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> समाधान </td><td> संदर्भ </td><td> अंतर्वस्तु </td></tr><tr><td> सेल संस्कृति मध्यम </td><td> चांग और स्पिट्जर, 2009 54 </td><td> 116 मिमी NaCl 0.67 मिमी KCl 2 मिमी 2 CACL 1.31 मिमी MgSO 4 4.6 मिमी Tris % 1 (v: v) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 7.8 एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करें. एक 0.22 सुक्ष्ममापी CN फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा बाँझ बनाना फ़िल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> कैल्शियम, मैग्नीशियम मुफ्त मध्यम (सीएमएफ) </td><td> गुजरात एट अल, +१९९४ 42, गुजरात और स्पिट्जर, 1995 55 </td><td> 116 मिमी NaCl 0.67 मिमी KCl 4.6 मिमी Tris 0.4 मिमी EDTA % 1 (v: v) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 7.8 एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करें. एक 0.22 सुक्ष्ममापी CN फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा बाँझ बनाना फ़िल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </td></tr><tr><td> Maleic एसिड बफर (एमएबी) </td><td> निर्णायक एट अल., २००० 53 </td><td> 100 मिमी maleic एसिड 150 मिमी NaCl (7.5 पीएच). </td></tr><tr><td> मार्क संशोधित (एमएमआर) Ringers, 10X </td><td> निर्णायक एट अल., २००० 53 </td><td> 100 मिमी NaCl मिमी KCl 1 मिमी MgSO 4 2 मिमी 2 CACL 5 मिमी HEPES पीएच 7.4 NaOH के साथ करने के लिए समायोजित 0.1X MMR भी 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर gentamicin सल्फेट और पीएच 7.4 NaOH के साथ समायोजित किया जाता है. </td></tr><tr><td> MEMFA समाधान 10X, </td><td> निर्णायक एट अल., २००० 53 </td><td> 0.1 एम MOPS (पीएच 7.4) 2 मिमी EGTA 1 मिमी MgSO 4 3.7% formaldehyde Formaldehyde बिना एक 10X समाधान, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है Formaldehyde ताजा जोड़ा जाता है (एक मानक 37% शेयर की मात्रा 1/10). </td></tr><tr><td> स्वस्थानी संकरण बफर में </td><td> Sivई एट अल., 53 2000 </td><td> 50% Formamide 5X एसएससी 1 मिलीग्राम / एमएल torula आरएनए 100 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन 1X Denhart समाधान 0.1% के बीच 20 0.1% CHAPS 10 मिमी EDTA. </td></tr></tbody></table> समाधान * Gentamicin, एक एंटीबायोटिक, हमारे MMR समाधान में प्रयोग किया जाता है, जबकि पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन हमारी संस्कृति मीडिया में उपयोग किया जाता है. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

सफलतापूर्वक dissected ऑप्टिक (25 चरण) vesicles और दृष्टिपटल (35 चरण) के उदाहरण 2E और 2j आंकड़े में दिखाया जाता है. जबकि इस प्रोटोकॉल के विकास के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है, यह केवल रेटिना ऊतक को प्राप्त करने क?...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis सेल भाग्य विनिर्देश और प्राथमिक सेल संस्कृति में व्यक्ति रेटिना की कोशिकाओं के शारीरिक कार्य के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम रेटिना ऊतकों विदारक और प्राथमिक सेल संस्कृतियों कि कैल्शियम गतिविधि के लिए imaged और स्वस्थानी संकरण द्वारा विश्लेषण पैदा करने के लिए एक तकनीक मौजूद है.

विच्छेदन, संस्कृति, और विश्लेषण<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; भ्रूण ऊतक रेटिना

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

एक माउस आँखों के रेटिना वर्णक उपकला के एक पूरे पर्वत के लिए विच्छेदन

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin आधारित और माउस भ्रूणीय motoneurons के अलगाव संस्कृति

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

अलगाव और चूहा भ्रूण तंत्रिका कोशिकाओं की संस्कृति: एक त्वरित प्रोटोकॉल

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

से तंत्रिका Explant संस्कृति<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

भ्रूण अग्रमस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

परीक्षण दृश्य समारोह में के लिए एक सरल व्यवहार परख<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

की घ्राण बल्ब में कैल्शियम परिवर्तन की निगरानी के माध्यम से रिकॉर्डिंग तापमान प्रेरित neuronal गतिविधि<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...