Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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我々は優雅にスクリプト用ドクタージョンヘイズに感謝;博士。エリック·ブラッドリーと共焦点顕微鏡の支援のためのクリストファー·デル·ネグロ、ドリュー·ヒューズ、プロジェクトを開発し、予備的なデータを提供する際に自分の仕事のためラウラOdorizzi、アレックスGarafalo、レベッカラウデン、とリズ·マクマレイ、統計分析に役立つ提案のための博士グレッグスミス。この作品は、MSSにNIHの助成金（NINDS IR15N5067566-01）とウィリアム·アンド·メアリー大学のハワードヒューズ医学研究所の科学教育助成金によって支えられている。

全ての実験は、ウィリアム·アンド·メアリー大学におけるインスティテューショナル·動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。このプロトコルで参照発達段階はNieuwkoopとフェーバー46によるとされています。 1。解剖<ol><li>細胞培養培地及び室温になじまカルシウムマグネシウム培地（CMF）を許可します。また、0.1X Marcの改変?...

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖と培養するための </td></tr><tr><td> BDファルコンイージーグリップ組織培養皿、35ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのポリスチレンペトリ皿、60×15ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35ミリメートルNunclon表面ペトリ皿（Airvent付き） </td><td>フィッシャー</td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td>デュモンファイン鉗子（Dumostar＃55） </td><td>フィッシャー</td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellatticeマイクロ支配プラスチックカバースリップ、25ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td>エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩（MS-222） </td><td> MPバイオメディカル、LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td>エンツォ生命科学</td><td> 380から003-G025 </td><td></td></tr><tr><td>ギブコトリプシン（1:250）パウダー</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> クロストリジウム·ヒストリチカムからのコラゲナーゼB </td><td>ロッシュ</td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>ナイルブルー硫酸（オプション） </td><td>ファルツ＆バウアー</td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500mlの真空フィルター/ストレージボトルシステム、孔径0.22μm33.2センチメートル2 CN膜</td><td>コー​​ニング</td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> カルシウムイメージングのための </td></tr><tr><td>のFluo-4は、DMSOで1mM溶液、永久細胞AM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td>水中でのプルロニックF-127の10％溶液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510共焦点顕微鏡システム</td><td>ツァイス</td><td>モデル廃止</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-POD、Fab断片</td><td>ロッシュ</td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td>抗DNP-HRP抗体</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3でNHSエステル</td><td> GEヘルスケア</td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-フルオレセイン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド、脱イオン</td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td>トルラRNA、IX型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td>ブタ腸粘膜からヘパリンナトリウム塩、 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2に特異的な試薬や機器。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td> リファレンス </td><td> 中身 </td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>チャンとスピッツァー、2009 54 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 2mMのCaCl 2 1.31 mMのMgSO 4を 4.6 mMトリス 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>カルシウム·マグネシウム培地（CMF） </td><td>グーら 、1994 42;。Guとスピッツァー、1995年55 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 4.6 mMトリス 0.4 mMのEDTA 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>マレイン酸バッファ（MAB） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのマレイン酸 150mMのNaCl（pH7.5）で。 </td></tr><tr><td> 10X Marcの修正リンガー（MMR） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのNaCl のKCl 1mMのMgSO 4を 2mMのCaCl 2 5mMのHEPES pHはNaOHで7.4に調整 0.1X MMRは、50 mg / mlの硫酸ゲンタマイシン及びpHをNaOHで7.4に調整されているが含まれています。 </td></tr><tr><td> 10X MEMFAソリューション、 </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td>の0.1M MOPS緩衝液（pH7.4） 2mMのEGTA 1mMのMgSO 4を 3.7％ホルムアルデヒド 10X溶液は、ホルムアルデヒドことなく、4℃で保存することができますホルムアルデヒドは（標準37％ストックの1/10量）新鮮追加されます。 </td></tr><tr><td> in situハイブリダイゼーション緩衝液中に </td><td> SIV電子ら 、2000年53 </td><td> 50％ホルムアミド 5X SSC 1 mg / mlのトルラRNA 100 mg / mlのヘパリン 1Xデンハルト溶液 0.1％のTween20 0.1％CHAPS 10mMのEDTA。 </td></tr></tbody></table>ペニシリンとストレプトマイシンが我々の文化メディアで使用されている間ソリューションを提供しています。*ゲンタマイシン、抗生物質は、私たちのMMRのソリューションで使用されています。 </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。 無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞を用いた7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル5,8,21,24,27-30,33-39に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達19,27,29,31-32,40-42は 、網膜の初代細胞培養10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。 推定網膜組織はすぐに神経誘導25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。 しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35?...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

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Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

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ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

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テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

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の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

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準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...