Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Vi graciously takke dr. John Hayes for skript; Drs. Eric Bradley og Christopher Del Negro for å få hjelp med konfokalmikroskopi, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, og Liz MacMurray for deres arbeid med å utvikle prosjektet og gi foreløpige data, Dr. Greg Smith for nyttige forslag på statistisk analyse. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend (NINDS IR15N5067566-01) til MSS og Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant til College of William and Mary.

Alle eksperimenter utføres etter protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved College of William and Mary. Utviklingsstadier refereres til i denne protokollen er i henhold til Nieuwkoop og Faber 46. 1. Disseksjon <ol><li> Tillat cellekulturmediet og kalsium magnesium fritt medium (CMF) å nå romtemperatur. Du vil også trenge 0.1X Marc Modified Ringer (MMR) pH 7.4 til 7.6. </li><li> Steriliser følgende elementer ved å bruke en UV-lys i 30 minutter i ...

Med sine godt karakterisert celletyper som er bevart på tvers av alle virveldyr, gir netthinnen en nyttig modell for å studere molekylære cellulære prosesser som styrer celletype spesifikasjon og differensiering. Primær cellekultur gir en kraftig metode for å undersøke en rekke prosesser, inkludert genekspresjon, protein dynamikk, og kalsium og elektriske aktiviteten på nivået av enkeltcelle oppløsning. Her presenterer vi en grei teknikk for primær cellekultur fra dissekert presumptive retinal vev i Xenop...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> For disseksjoner og dyrking </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip vevskultur Retter, 35 mm </td><td> Fisher </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Disponibel Isopor petriskåler, 60 x 15 mm </td><td> Fisher </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Surface petriskåler (med Airvent) </td><td> Fisher </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Fin tang (Dumostar # 55) </td><td> Fisher </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-styrte plast dekkglass, 25 mm </td><td> Fisher </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Etyl-m-aminobenzoat metansulfonat Salt (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin sulfat </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco Trypsin (1:250) Powder </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase B fra Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue Sulfate (valgfritt) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml vakuumfilteret / Storage Bottle System, 0,22 mikrometer Pore 33,2 cm 2 CN Membran </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> For kalsium Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM Solution i DMSO, Cell Permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% løsning i vann </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Confocal Microscope System </td><td> Zeiss </td><td> Modellen Utgått </td><td></td></tr><tr><td> Blokkering Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> For Fluorescent in situ hybridisering (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-pod, Fab Fragments </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP Antistoff </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid, deionisert </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, Type IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin Sodium Salt, fra gris tarmslimhinnen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Spesifikke reagenser og utstyr. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Oppløsning </td><td> Referanse </td><td> Innhold </td></tr><tr><td> Cellekulturmedium </td><td> Chang og Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSo4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Juster pH til 7,8 med HCl. Filtrer sterilisere ved å passere gjennom et 0,22 um CN filter. Oppbevar ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> Kalsium-Magnesium Gratis Medium (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42,. Gu og Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Juster pH til 7,8 med HCl. Filtrer sterilisere ved å passere gjennom et 0,22 um CN filter. Oppbevar ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> Maleinsyre Buffer (MAB) </td><td> Tende et al. 2000 53 </td><td> 100 mM maleinsyre 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marc Modified Ringers (MMR), 10X </td><td> Tende et al. 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSo4 2 mM CaCl 2 5 mM HEPES pH justert til 7,4 med NaOH 0.1X MMR inneholder også 50 mg / ml gentamicin sulfat og pH justeres til 7,4 med NaOH. </td></tr><tr><td> MEMFA Solution, 10X </td><td> Tende et al. 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSo4 3,7% formaldehyd En 10X løsning, uten formaldehyd, kan lagres ved 4 ° C. Formaldehyd tilsettes fersk (1/10 volum av en standard 37% lager). </td></tr><tr><td> In situ hybridisering Buffer </td><td> Sive et al. 2000 53 </td><td> 50% formamid 5X SSC 1 mg / ml Torula RNA 100 mg / ml Heparin 1X Denhart løsning 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Løsninger. * Gentamicin, et antibiotikum, er brukt i våre MMR løsninger mens penicillin og streptomycin er brukt i våre dyrkingsmedier. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Den prosessen som den fremre delen av nevrale plate gir opphav til virveldyr netthinnen fortsetter å være et stort fokus på både klinisk og grunnleggende forskning. I tillegg til de åpenbare medisinsk relevans for å forstå og behandle retinal sykdom, fortsetter utviklingen av virveldyr netthinnen å tjene som et viktig og elegant modellsystem for forståelse neuronal celletype bestemmelse og differensiering 1-16. Det nevrale netthinnen består av seks diskrete celletyper (ganglion, amacrine, horisontal, fotoreseptorer, bipolare celler, og Muller gliacellene) ordnet i stereotype lag, et mønster som er i stor grad bevart blant alle virveldyr 12,14-18. Mens han studerte netthinnen i intakt utvikling av embryo er klart nødvendig for å forstå hvordan dette komplekse organ utvikler seg fra en utvekst av forebrain inn en lagdelt struktur, er det mange spørsmål som er til fordel from ansette tilnærminger med primær cellekultur av presumptive netthinnens celler 7,19-23. For eksempel, å analysere celler fra vev fjernet og dissosiert på forskjellige stadier tillater en å skjelne staten spesifikasjonen av individuelle celler på ulike utviklingsstadier, dvs. skjebnen av cellene i fravær av interaksjoner med nærliggende vev 8,19-22 ,24-33. Primære cellekulturer kan også etterforsker for å behandle kultur med spesifikke reagenser og analysere resultatene på en enkelt celle nivå 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, en klassisk modell system for studiet av tidlig nevral utvikling 19,27,29,31-32,40-42, fungerer som en spesielt egnet system for retinal primære cellekulturer 10,38,43-45. Presumptive retinal vev er tilgjengelig fra de tidligste stadiene av utviklingen, umiddelbart etter nevrale induksjon 25,38,43. I tillegg gis thved hver celle i embryoet inneholder en tilførsel av eggeplomme, kan netthinnens celler dyrkes i en svært enkel definerte medier bestående av en bufret salt-løsning, og dermed fjerne forstyrrende effekter av inkubering eller andre sera-baserte produkter 10,24,44-45 . Imidlertid er isolasjon av retinal vev fra omkringliggende vev og påfølgende behandling utfordrende. Her presenterer vi en fremgangsmåte for disseksjon og dissosiasjon av netthinnens celler i Xenopus laevis som skal anvendes for å fremstille primære cellekulturer som vil, i sin tur, blir analysert for kalsium aktivitet og genekspresjon på oppløsningen av enkeltceller. Mens temaet presenteres i denne artikkelen er analysen av spontane kalsium transienter, er teknikken bredt gjeldende for et bredt spekter av problemstillinger og tilnærminger (figur 1).

Eksempler på vellykket dissekert optikk vesikler (stadium 25) og retinae (stadium 35) er vist i figurene 2E og 2J. Mens denne protokollen kan brukes på ulike stadier i utviklingen, er det avgjørende å få bare retinal vev for å sikre nøyaktighet for nye eksperimenter. Fjern forsiktig epidermis i alle ledd og sikre at tang ikke punktere retinal vev. I stadium 35 eller eldre, kan linsen bli sett på som et klart lag på toppen av netthinnen og kan fjernes ved forsiktig skraping med tang. <p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis gir en ideell modell system for å studere cellen skjebne spesifikasjon og fysiologiske funksjon av individuelle netthinnens celler i grunnskolen cellekultur. Her presenterer vi en teknikk for å dissekere retinal vev og generere primære cellekulturer som er avbildet for kalsium aktivitet og analysert ved in situ hybridisering.

Disseksjon, kultur, og analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Retinal Tissue

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering og kultur Rat Embryonale nevrale celler: En rask protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Eksplantasjon kulturer fra<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolasjon og kultur av endotelceller fra Embryonale brain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

En enkel Behavioral analysen for Testing visuell funksjon i<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opptak Temperatur-indusert neuronal aktivitet gjennom Overvåking Kalsium endringer i luktelappen av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i Xenopus laevis Tectal nerveceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...