Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
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Nos cortésmente las gracias al Dr. John Hayes para los scripts, los Dres. Eric Bradley y Christopher Del Negro para obtener ayuda con la microscopía confocal, de Drew Hughes, Laura Odorizzi, Garafalo Alex, Rebecca Lowden, y Liz MacMurray por su trabajo en el desarrollo del proyecto y proporcionar datos preliminares, el Dr. Greg Smith por sus útiles sugerencias sobre el análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (NINDS IR15N5067566-01) para el SMS y el Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant al Colegio de William y Mary.

Todos los experimentos se llevan a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Colegio de William y Mary. Etapas de desarrollo hace referencia en este protocolo son de acuerdo a Nieuwkoop y Faber 46. 1. Disección <ol><li> Permitir que el medio de cultivo celular y medio libre de calcio magnesio (CMF) se equilibre a temperatura ambiente. Usted también necesitará Modificado 0,1 X de Marc Ringer (MMR) pH 7.4-7.6. </li><li> E...

Con sus tipos celulares bien caracterizadas que se conservan en todos los vertebrados, la retina proporciona un modelo útil para el estudio de los procesos moleculares-celulares que regulan la especificación del tipo de célula y la diferenciación. Cultivo celular primario proporciona un método potente para la investigación de una gran variedad de procesos que incluyen la expresión génica, la dinámica de proteínas y el calcio y la actividad eléctrica en el nivel de resolución única célula. A continuación l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Para las disecciones y Cultivo </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip placas de cultivo tisular de 35 mm, </td><td> Pescador </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Platos desechables de poliestireno Petri, 60 x 15 mm </td><td> Pescador </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon superficie Petri Dishes (con Airvent) </td><td> Pescador </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Fine Pinzas (Dumostar # 55) </td><td> Pescador </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-dictaminó cubreobjetos de plástico, 25 mm </td><td> Pescador </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Etil-m-aminobenzoato de metanosulfonato de sal (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de Gentamicina </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco tripsina (1:250) en polvo </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa B de Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nilo Azul Sulfato (opcional) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml de vacío Filtro / almacenamiento de botellas del sistema, 0,22 micras de poro 33,2 cm 2 de membrana CN </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Para obtener imágenes de calcio </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM en solución de DMSO, Cell Permanente </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% de solución en agua </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 sistema de microscopio confocal </td><td> Zeiss </td><td> Modelo Descatalogado </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo bloqueador </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Por hibridación fluorescente in situ (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-Pod, fragmentos Fab </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP Anticuerpo </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3Éster de NHS </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-fluoresceína </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida desionizada, </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula ARN, Tipo IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Sal sódica de heparina, a partir de mucosa intestinal porcina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Solución </td><td> Referencia </td><td> Contenido </td></tr><tr><td> Medio de cultivo celular </td><td> Chang y Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicilina / Estreptomicina Ajustar el pH a 7,8 con HCl. Esterilizar por filtración mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras CN. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcio-Magnesio medio libre (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42;. Gu y Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicilina / Estreptomicina Ajustar el pH a 7,8 con HCl. Esterilizar por filtración mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras CN. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampón de ácido maleico (MAB) </td><td> Sive y col., 2000 53 </td><td> 100 mM de ácido maleico 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marc Modificado Ringers (MMR), 10 veces más </td><td> Sive y col., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM CaCl 2 5 mM de HEPES pH ajustado a 7,4 con NaOH 0,1 X MMR también contiene 50 mg / ml de sulfato de gentamicina y el pH se ajustó a 7,4 con NaOH. </td></tr><tr><td> Solución MEMFA, 10X </td><td> Sive y col., 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO 4 3,7% de formaldehído Una solución de 10 veces, sin formaldehído, se puede almacenar a 4 ° C. El formaldehído se añadió fresco (1/10 de volumen de un patrón madre 37%). </td></tr><tr><td> En tampón de hibridación in situ </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 50% de formamida 5X SSC 1 mg / ml de ARN Torula 100 mg / ml de heparina Solución Denhart 1X de 0,1% de Tween 20 CHAPS 0,1% 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Soluciones. * Gentamicina, un antibiótico, se usa en nuestras soluciones MMR mientras penicilina y estreptomicina se utilizan en los medios de nuestra cultura. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

El proceso por el que la región anterior de la placa neural da lugar a la retina de vertebrados sigue siendo un foco importante de investigación tanto clínica como básica. Además de la evidente importancia médica para la comprensión y el tratamiento de enfermedades de la retina, el desarrollo de la retina de vertebrados continúa sirviendo como un importante sistema modelo y elegante para la comprensión neuronal determinación de tipo celular y la diferenciación 1-16. La retina neural consta de seis tipos de células discretas (ganglio, fotorreceptores amacrinas, horizontal,, células bipolares, y las células gliales de Müller) dispuestas en capas estereotipadas, un patrón que es muy conservada entre todos los vertebrados 12,14-18. Si bien el estudio de la retina en el embrión en desarrollo está intacto claramente necesaria para la comprensión de cómo este órgano complejo se desarrolla a partir de una protuberancia del cerebro anterior en una estructura en capas, hay muchas preguntas que benefician from empleando métodos que utilizan cultivos celulares primarios de presuntas células de la retina 7,19-23. Por ejemplo, el análisis de las células de los tejidos y se disocia en diferentes etapas permite discernir el estado de la especificación de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, es decir, el destino de las células en la ausencia de interacciones con los tejidos vecinos 8,19-22 ,24-33. Cultivo de células primarias también permite al investigador para tratar el cultivo con reactivos específicos y analizar los resultados en un nivel de célula única 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un sistema modelo para el estudio clásico de desarrollo neural temprano 19,27,29,31-32,40-42, sirve como un sistema particularmente adecuado para el cultivo de células primarias de retina 10,38,43-45. Tejido de la retina presuntiva se puede acceder desde las primeras etapas de desarrollo, inmediatamente después de la inducción neural 25,38,43. Además, dado then cada célula en el embrión contiene un suministro de yema de huevo, células de la retina pueden ser cultivadas en un medio de comunicación muy simples definidos que consisten en una solución salina tamponada, eliminando así los efectos de confusión de incubación o de otros sueros de los productos basados ​​en 10,24,44-45 . Sin embargo, el aislamiento del tejido de la retina de los tejidos circundantes y el posterior procesamiento es un reto. Aquí, se presenta un método para la disección y disociación de las células de la retina en Xenopus laevis que se usa para preparar cultivos de células primarias que, a su vez, se analizó la actividad de calcio y la expresión génica en la resolución de las células individuales. Si bien el tema presentado en este documento es el análisis de los transitorios de calcio espontáneos, la técnica es ampliamente aplicable a una amplia gama de temas de investigación y enfoques (Figura 1).

Ejemplos de éxito disecados vesículas ópticas (etapa 25) y retinas (etapa 35) se muestran en las Figuras 2E y 2J. Aunque este protocolo se puede utilizar en varias etapas de desarrollo, es crítico para obtener sólo tejido de la retina para asegurar la precisión para experimentos adicionales. Retire con cuidado la epidermis en todo momento y asegurarse de que las pinzas no perforar el tejido de la retina. En la etapa 35 años o más, la lente puede ser visto como una capa transparente en la parte s...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

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