Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Vi tackar nådigt Dr John Hayes för skript, Dr. Eric Bradley och Christopher Del Negro för hjälp med konfokalmikroskopi, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, och Liz MacMurray för deras arbete med att utveckla projektet och ge preliminära data, Dr Greg Smith för bra tips på statistisk analys. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag (NINDS IR15N5067566-01) till MSS och en Howard Hughes Medical Institute Science Education Bidrag till College of William and Mary.

Alla experiment utförs följande protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid College of William and Mary. Utvecklingsstadier hänvisas till i detta protokoll är enligt Nieuwkoop och Faber 46. 1. Dissektion <ol><li> Låt cellodlingsmediet och Kalcium Magnesium medium (CMF) jämviktas till rumstemperatur. Du behöver också 0,1 X Marcs Modifierad Ringers (MMR) pH 7,4-7,6. </li><li> Sterilisera följande genom att tillämpa en UV-ljus under...

Med sina välkarakteriserade celltyper som är konserverade i alla ryggradsdjur, ger näthinnan en användbar modell för att studera molekylär cellulära processer som styr specifikation celltyp och differentiering. Primär cellkultur ger en kraftfull metod för att undersöka ett stort antal processer, inklusive genexpression, dynamik protein och kalcium och elektrisk aktivitet vid nivån för en enda cell upplösning. Här presenterar vi en enkel teknik för primär cellodling från dissekerade presumtiva näthinnev...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> För Dissektioner och odling </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip Tissue Culture rätter, 35 mm </td><td> Fisher </td><td> 08-772a </td><td></td></tr><tr><td> Disponibel Polystyren petriskålar, 60 x 15 mm </td><td> Fisher </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Surface Petriskålar (med Airvent) </td><td> Fisher </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont fin pincett (Dumostar # 55) </td><td> Fisher </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-regerade plast täckglas, 25 mm </td><td> Fisher </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Etyl-m-aminobensoat metansulfonatsalt (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103.106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicinsulfat </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco Trypsin (1:250) Pulver </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenas B från Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue sulfat (tillval) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml vakuumfilter / förrådsflaskan System, 0,22 um Pore 33,2 cm 2 KN Membran </td><td> Corning </td><td> 430.758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> För kalcium Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM lösning i DMSO, Cell Permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14.217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% lösning i vatten </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 konfokalmikroskop System </td><td> Zeiss </td><td> Modell Avvecklade </td><td></td></tr><tr><td> Blockering Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> För fluorescent in situ hybridisering (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-POD, Fab-fragment </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-antikropp HRP </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS-ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46.409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid, Avjoniserat </td><td> Amresco </td><td> 0606-950 ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula-RNA, typ IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin natriumsalt, från svintarmslemhinna </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> LÄDERBYXOR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Specifika reagens och utrustning. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Lösning </td><td> Referens </td><td> Innehåll </td></tr><tr><td> Cellodlingsmedium </td><td> Chang och Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (volym: volym) penicillin / streptomycin Justera pH till 7,8 med HCl. Filtersterilisera genom passage genom en 0,22 fim CN filter. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> Kalcium-Magnesium fritt medium (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42,. Gu och Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (volym: volym) penicillin / streptomycin Justera pH till 7,8 med HCl. Filtersterilisera genom passage genom en 0,22 fim CN filter. Förvaras vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> Maleinsyra buffert (MAB) </td><td> Sive et al. 2000 53 </td><td> 100 mM maleinsyra 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marcs Modifierad Ringers (MMR), 10X </td><td> Sive et al. 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH justerat till 7,4 med NaOH 0,1 X MMR innehåller även 50 mg / ml gentamicinsulfat och pH justeras till 7,4 med NaOH. </td></tr><tr><td> MEMFA lösning, 10X </td><td> Sive et al. 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO 4 3,7% formaldehyd En 10X lösning, utan formaldehyd, kan lagras vid 4 ° C. Formaldehyd sättes färsk (1/10 volym av en standard 37% lager). </td></tr><tr><td> In situ-hybridiseringsbuffert </td><td> SIVe et al. 2000 53 </td><td> 50% formamid 5X SSC 1 mg / ml Torula-RNA 100 mg / ml heparin 1X Denharts lösning 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Lösningar. Har * Gentamicin, ett antibiotikum, som används i våra MMR lösningar samtidigt penicillin och streptomycin används i vår kultur media. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Den process genom vilken den främre regionen av neurala plattan ger upphov till ryggradsdjur näthinnan fortsätter att vara ett stort fokus på både klinisk forskning och grundforskning. Förutom den uppenbara medicinska relevans för att förstå och behandla näthinnesjukdom, fortsätter utvecklingen av ryggradsdjur näthinnan att fungera som ett viktigt och elegant modell för att förstå neuronala celltyp bestämning och differentiering 1-16. Den neurala näthinnan består av sex separata celltyper (ganglion, amacrine, horisontella, fotoreceptorer, bipolära celler och Muller gliaceller) arrangerade i stereotypa lager, ett mönster som till stor del är bevarad bland alla ryggradsdjur 12,14-18. Medan de studerar näthinnan i intakt utvecklande embryot är klart krävs för att förstå hur denna komplexa organ utvecklas från ett utsprång av framhjärnan till en skiktad struktur, det finns många frågor som gynnar tillbakam anställa metoder som använder primär cellkultur av presumtiva retinala celler 7,19-23. Till exempel, analysera celler från vävnader avlägsnats och dissocierad i olika skeden gör att man kan urskilja tillstånd specificering av individuella celler vid olika utvecklingsstadier, dvs öde cellerna i frånvaro av interaktioner med närliggande vävnader 8,19-22 ,24-33. Primär cellodling ger också utredaren att behandla kulturen med specifika reagens och analysera resultaten på en enda cell nivå 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ett klassiskt modellsystem för att studera tidig neural utveckling 19,27,29,31-32,40-42, fungerar som en särskilt lämplig för retinal primär cellkultur 10,38,43-45. Presumtiv näthinnevävnad är tillgänglig från de tidigaste utvecklingsstadierna, omedelbart efter neural induktion 25,38,43. Med tanke på thvid varje cell i embryot innehåller ett förråd av äggula, kan retinala celler odlas i ett definierat mycket enkel medier bestående av en buffrad saltlösning och därmed undanröja de förbryllande effekterna av inkubering eller andra serum-baserade produkter 10,24,44-45 . Emellertid är isoleringen av den retinala vävnaden från omgivande vävnader och den efterföljande bearbetningen utmanande. Här presenterar vi en metod för dissektion och dissociation av näthinneceller i Xenopus laevis som kommer att användas för att framställa primära cellkulturer som, i sin tur, kan analyseras för kalcium aktivitet och genexpression vid upplösningen av enskilda celler. Medan ämnet som presenteras i denna uppsats är en analys av spontana kalcium transienter är tekniken brett tillämpbar för ett brett spektrum av frågeställningar och metoder (figur 1).

Exempel på framgångsrikt dissekerade optiska vesiklar (steg 25) och retinae (steg 35) visas i figurerna 2E och 2J. Även detta protokoll kan användas i olika stadier av utveckling, är det viktigt att erhålla endast näthinnevävnad att säkerställa noggrannheten för ytterligare experiment. Ta försiktigt bort epidermis i alla led och se till att dina pincett inte punktera näthinnevävnad. I steg 35 eller äldre, kan linsen ses som ett klart skikt ovanpå näthinnan och kan avlägsnas genom förs...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis ger en idealisk modell för att studera specifikation cellöde och fysiologisk funktion hos individuella retinala celler i primär cellkultur. Här presenterar vi en teknik för dissekera retinal vävnad och generera primära cellkulturer som avbildas för kalcium aktivitet och analyserades genom in situ hybridisering.

Dissektion, kultur, och analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonala näthinnevävnad

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lektin-baserade isolering och odling av mus Embryonala Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering och kultur råttembryonala neurala celler: En snabb protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neurala Explantation kulturer från<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

En enkel Behavioral analys för Testa Visual Function i<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Inspelning Temperatur-inducerad neuronal aktivitet genom att övervaka Kalcium Förändringar i luktbulben av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...