Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Biz nezaketle betikleri için Dr John Hayes ederim; Dr. Eric Bradley ve konfokal mikroskopi için yardım Christopher Del Negro, Drew Hughes, proje geliştirme ve ön veriler sağlayan çalışmaları için Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, ve Liz MacMurray; istatistiksel analize yararlı önerileri için Dr Greg Smith. Bu çalışma MSS bir NIH hibe (NINDS IR15N5067566-01) ve William and Mary College Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fen Bilgisi Eğitimi Hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler William and Mary College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip yapılmaktadır. Bu protokolde atıfta Gelişim aşamaları Nieuwkoop ve Faber 46 göredir. 1. Teşrih <ol><li> Hücre Kültürü Orta ve oda sıcaklığına gelmesini Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) izin verin. Ayrıca 0,1 X Marc Modifiye Ringer (MMR) pH 7.4-7.6 gerekir. </li><li> Bir hücre kültür laminer akış başlık içinde 30 dakika süre...

Tüm omurgalılar arasında muhafaza edilir, iyi karakterize hücre tipleri ile, retinanın hücre tipi özellikleri ve farklılaşma yöneten molekül hücresel süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlamaktadır. Birincil hücre kültürü ve gen ekspresyonu, protein dinamiği, ve kalsiyum ve tek bir hücre çözünürlük düzeyde elektrik etkinlik içeren işlemler çok çeşitli araştırma için güçlü bir yöntem tanıyor. Burada varsayımsal Retina gelişimi ve primer hücre kültürü çok erken a?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Diseksiyonlarında ve Kültürleme için </td></tr><tr><td> BD Falcon Kolay Tutuş Doku Kültürü Yemekleri, 35 mm </td><td> Balıkçı </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Tek Polistiren Petri Yemekleri, 60 x 15 mm </td><td> Balıkçı </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Yüzey Petri kaplar (Airvent ile) </td><td> Balıkçı </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Güzel Forseps (Dumostar # 55) </td><td> Balıkçı </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Mikro-yönetilen plastik lamel, 25 mm </td><td> Balıkçı </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Etil-m-aminobenzoat metansülfonat Tuz (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin Sülfat </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco Tripsin (1:250) Toz </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Clostridium histolyticum gelen Kollajenaz B </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue Sülfat (isteğe bağlı) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml Vakum Filtre / Depolama Şişe Sistemi, 0.22 mikron gözenek 33.2 cm 2 CN Membran </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Kalsiyum For Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 DMSO içinde 1 mM Çözüm, Daimi Hücre AM </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Su Pluronic F-127% 10 Çözüm </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Konfokal Mikroskop Sistemi </td><td> Zeiss </td><td> Model Üretilmeyen </td><td></td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> In situ hibridizasyon Floresan (FISH) için </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-POD, Fab Fragments </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP antikor </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Floresein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid, Deiyonize </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, tip IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Domuz intestinal mukozadan Heparin Sodyum Tuz, </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanlar. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Referans </td><td> Içindekiler </td></tr><tr><td> Hücre Kültürü Orta </td><td> Chang ve Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris % 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin HCl ile 7.8 pH ayarlayın. 0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin. 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> Kalsiyum-Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42;. Gu ve Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA % 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin HCl ile 7.8 pH ayarlayın. 0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin. 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> Maleik Asit Tampon (MAB) </td><td> Sive ve ark., 2000 53 </td><td> 100 mM maleik asit 150 mM NaCl (pH 7.5). </td></tr><tr><td> 10X Marc Modifiye Ringers (MMR), </td><td> Sive ve ark., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH NaOH ile 7.4 &#39;e ayarlandı 0,1 X MMR da 50 mg / ml gentamisin sülfat ve pH, NaOH ile 7.4 &#39;e ayarlanır içerir. </td></tr><tr><td> MEMFA Çözüm, 10X </td><td> Sive ve ark., 2000 53 </td><td> 0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 % 3,7 formaldehit 10X bir çözelti, formaldehit olmaksızın, 4 ° C&#39;de saklanabilir Formaldehit (% 37, standart bir stok, 1/10 hacim), taze ilave edilir. </td></tr><tr><td> In situ Hibridizasyon Tamponu In </td><td> SivE ve diğ., 2000 53 </td><td> 50% Formamid 5X SSC 1 mg / ml Torula RNA 100 mg / ml heparin 1X Denhart Çözümü % 0.1 Tween 20 % 0.1 CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Penisilin ve streptomisin bizim kültür ortamı olarak kullanılabilir yaparken çözümler. * Gentamisin, bir antibiyotik, bizim MMR çözüm olarak kullanılır. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Nöral plaka ön bölgede gözdeki doğurur hangi süreci klinik ve temel hem de araştırma önemli bir odak noktası olmaya devam ediyor. Retina hastalığı anlaşılması ve tedavi edilmesi için, bariz bir tıbbi uygunluk ilave olarak, omurgalı retina gelişimi nöronal hücre tipi anlaşılmasını kararlılık ve farklılaşması için 1-16 ve önemli bir şık model sistemi olarak hizmet etmektedir. Nöral retinada basmakalıp katmanlar halinde düzenlenmiş altı ayrı hücre tipleri (gangliyon, yatay, amacrine fotoreseptör, bipolar hücreleri ve Müller glial hücreler), büyük ölçüde tüm omurgalıların 12,14-18 arasında korunduğunu bir deseni oluşur. Sağlam gelişen embriyo retina okuyan açıkça bu kompleks organ katmanlı bir yapıya önbeyin bir çıkıntı gelişir nasıl anlaşılması için gerekli iken, fro yararlanacak pek çok soru varm varsayımsal retina hücrelerinin primer hücre kültürü 7,19-23 kullanarak yaklaşımlarının uygulanması. Örneğin, farklı aşamalarında kaldırılır ve ayrışmış dokulardan hücrelerin analiz biri farklı gelişim aşamalarında tek tek hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi durumu ayırt etmek için izin verir, bu ise, komşu dokulara 8,19-22 ile etkileşimi yokluğunda hücrelerin kaderini ,24-33. Primer hücre kültürü de araştırmacının belirli reaktifleri ile kültür tedavi ve tek hücre düzeyinde 5,8,21,24,27-30,33-39 üzerindeki sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Xenopus laevis, çalışma için klasik bir model sistem erken nöral gelişim 19,27,29,31-32,40-42, retina birincil hücre kültürü 10,38,43-45 için özellikle uygun bir sistem olarak hizmet vermektedir. Presumptive retina dokusunun hemen nöral indüksiyon 25,38,43 takiben, gelişiminin erken aşamalarında erişilebilir. Buna ek olarak, inci verilmişembriyo her hücre sarısı bir kaynağı da içerir, retina hücreleri tamponlanmış bir tuz çözeltisi, çok basit bir tanımlandığı ortamda kültüre edilebilir, böylece kuluçka veya diğer serum bazlı ürünlerin 10,24,44-45 şaşırtıcı etkileri kaldırma . Bununla birlikte, çevre dokular ve daha sonraki işleme retina dokusunun izolasyon zordur. Burada da, tek bir hücre çözünürlükte kalsiyum etkinlik ve gen ekspresyonu için analiz edilecek birincil hücre kültürleri hazırlamak için kullanılır Xenopus laevis retina hücreleri disseksiyon ve ayrılma için bir yöntem sunmaktır. Bu yazıda sunulan konuyu kendiliğinden kalsiyum Transientlerin analiz ederken, teknik araştırma soruları ve yaklaşımlar (Şekil 1), geniş bir dizi geniş uygulanabilir.

Başarılı bir şekilde parçalanmış, optik vezikülleri (aşama 25) ve retinae (aşama 35) örnekleri Şekiller 2E ve 2J gösterilmiştir. Bu protokol geliştirme çeşitli aşamalarında kullanılabilir olsa da, daha fazla deneyler için doğruluğunu sağlamak için sadece retina dokusunun elde etmek önemlidir. Dikkatle tüm aşamalarında epidermisin kaldırmak ve forseps retina dokusunun ponksiyon olmamasını sağlamak. Aşama 35 veya daha büyük ise, mercek retina üzerinde bir katman açık...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Test Görsel Fonksiyonu için Basit Bir Davranış Testi<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...